蛋白质与蛋白组学

请问老师：

曝光后背景颜色深该怎么解决？除了一抗、二抗的纯度，洗膜时间，还有哪些因素么？

跑β-actin的条带连成一片是否与上样量过多有关？

多谢版主~~

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1、连成一片与上样量大有关（还有ECL敏感性高、曝光时间长等）
2、背景深还有可能是抗体孵育时间过长、ECL敏感性（这点与二抗还有关系）

请教一下老师：
我刚学western一个多月，最近做了几次，一抗分别用的是β-actin（1：1000）和smad3(鼠单克隆抗体1:200)，背景很干净，只有些许大分子杂带，但没有出现想要的条带.
我实验的条件是：蛋白上样量80ug，上样总体积20ul。电泳液和转移液都是新配的，电泳：5%积层胶 80v 45min ；10%分离胶 120v 2h。转膜用的是PVDF膜，2.5h，350mA。 一抗过夜，二抗结合2h，用的是millipore的发光，暗盒曝光30s，90s，3min。
一抗购自santa cruz ，β-actin买了有大半年了，曾经被人放在-20℃中一两周，smad3是新近购买的。因为2009年12月底时做过一次相同条件的，但蛋白上样量是50ug，β-actin条带十分清晰，但有一两条颜色稍淡，所以就决定提高蛋白上样量，结果只出现一次，但是相当的深浅不一，之后就再也没出来过。考虑到效价降低我昨天做时就把浓度调整到1：500，仍旧不行。而smad3则一直未出现过较好的条带，有时背景是有点深但呈斑驳状的，条带若有似无。这次我也将浓度调到1：100，背景洗的很干净，仍无条带。
望老师帮我指条明路啊！！

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1、santa的beta-actin抗体还是很不错的。在-20冻着不会有太大影响，融化后抗体会有部分降解
2、等beta-actin的条件摸好后如果smad3还是不能出结果，我建议你换抗体吧

楼主您好，刚开始做很多地方不懂，我想问一下，高血压1型和3型胶原分子量大小怎么知道啊？内参老是做不出来是怎么回事？

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狂晕
做不出来问题很多
你这两句话好难回答

胸主动脉外膜成纤维细胞TGF-β1、SM α-actin、I型及III型胶原肽蛋白，这四种蛋白的分子量怎么知道？这些指标跑电泳时所用的电压和时间该如何控制？配什么浓度的分离胶和浓缩胶合适？转膜时用多少电流，多长时间？我的问题比较低级，希望老师耐心解答。谢谢

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1、分子量具体多少请参考文献与你想要买的抗体说明书上所标记的
2、分离胶浓度与你的目的蛋白分子量有关，选择不同的胶浓度。浓缩胶选择5%就可以（分子量很大的话可以选择4%）
3、转膜电流可以采用300mA恒流、时间与胶厚度、浓度、分子量大小有关
4、电泳电压可以选择90V进分离胶后换150或者180V，时间通过marker来确定

我有两个问题请前辈指点下：
1.提取的核蛋白可以用β-Actin作为内参么？
2.同样的WB条件，但每次出来的条带都不一样（也有时候是前几个泳道的带出来了，有时候又是另外几个泳道的条带出来），但是Mark都能出来，这是什么原因呢？
谢谢先！！！

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1、加大一抗孵育体系
2、转膜后用丽春红染色检查转膜是否一致
3、marker是纯蛋白，转到膜上不管多少都会有一些条带

我做的蛋白分子量是220，上样按100ul上的，湿转3.5小时，牛奶封闭了10min,一抗1：200用牛奶稀释4°过夜，二抗1：1500 2小时，显色甬道很深，目的蛋白很浅，我该怎么做？

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泳道深？条带浅？
是不是胶被污染了？
有时候不同的一抗也会有这样的情况
封闭延长到30min

谢谢您的回复。
我用的一抗是从文献中查到的，分别购于SIGMA和Calbiochem公司。ECL为碧云天公司。我还想请教您：直接从细胞板上加提取液提取细胞　和把细胞消化到EP管中，再加提取液有取别吗？我比较下，从板上直接提取蛋白的要好很多，不知您有没有这样的经验？ 您在哪家公司，不方便公开说，就短信告诉我吧，谢谢先。

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1、这两家公司的抗体都不错
2、碧云天公司的ECL敏感性稍微差了点，可以用更加敏感的ECL
3、有些客户拿过来的时候是消化后的细胞收集在EP管中提取蛋白，如果是我自己做的话我喜欢直接加裂解液到培养板或皿提取蛋白。你说的这个经验当然有了。呵呵

就是TH，60左右吧，我们用的一抗浓度是1：200，000，会不会太低了呢?
另外想问下版主，如果我想查使用多少浓度的抗体，该去哪里找呢？

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看抗体说明书啊

请教老师：

1.我想重复使用用曝过光的膜，是必须洗脱抗体重孵一抗还是不洗脱直接再孵二抗就行？

2.我用两株不同细胞的蛋白裂解物做WB，孵同一种一抗，结果是一株曝出两条带（其中一条是目的大小，另一条距离很近），而另一株就只有一条目的条带，这可能是什么原因？

谢谢！

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1、第一条没理解你要具体怎么做
2、与细胞株本身的蛋白有关（如果操作上都一致的话：裂解液相同、同一批次提取蛋白。。。。。）