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标题:【讨论帖】western blot问题解答

sunnyB[使用道具]
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发表于 2013-3-2 15:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
1、第一条没理解你要具体怎么做

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不好意思，我的意思是我已经曝过一次光，因为曝出来的图像效果不好，暂时将那张膜保存在TBST里，准备下次重新曝光，在这种情况下，那张膜我是应该洗脱后重孵一抗，还是在不用孵一抗只需放回二抗中再孵一小时就行？谢谢！
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发表于 2013-3-2 15:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
如果我做的是血清样品应该用什么内参比较好呢？我现在用的是β-actin,也能出来比较好的条带
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utt0989[使用道具]
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发表于 2013-3-2 15:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我有两个问题想要请教一下:
第一个:转移缓冲液到底该用哪个配方好呢?是Tris-base 5.8g 甘氨酸 2.9g 甲醇 200ml SDS 0.37g呢还是甘氨酸 3g Tris 14.4g SDS 1g 甲醇 200ml 加蒸馏水至 1000ml呢?
第二个:TBST中加0.1%的Tween-20呢还是0.05%的Tween-20呢?
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发表于 2013-3-2 15:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

非常感谢你的回答！！
我做的是TIMP2，大鼠的，SantaCruz的抗体标记的是21KD，BIOworld抗体标记在34-26之间，所以一并问了！
BIO-BAD的半干转膜仪，连接的是BIO-BAD自家的PowerPac HC Power Supply电源，设置恒压的较为方便，再请教一下，恒压转膜条件？？
胶面积较小，设置恒流的话，计算出来只有20几个mA ,而电源设置选项上只有A单位，只能精确到0.01A，所以设置条件不准确！如何解决？
还有一个问题，最近是新鲜配制的丙烯酰胺，若是这个不准确的话，会有什么样的影响？？
谢谢~~~
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发表于 2013-3-2 15:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
不好意思，我的意思是我已经曝过一次光，因为曝出来的图像效果不好，暂时将那张膜保存在TBST里，准备下次重新曝光，在这种情况下，那张膜我是应该洗脱后重孵一抗，还是在不用孵一抗只需放回二抗中再孵一小时就行？谢谢！

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1、你要在TBST里放置多长时间再次曝光？
2、如果时间长的话可以从一抗、二抗开始
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发表于 2013-3-2 15:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
如果我做的是血清样品应该用什么内参比较好呢？我现在用的是β-actin,也能出来比较好的条带

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GAPDH
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发表于 2013-3-2 15:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我有两个问题想要请教一下:
第一个:转移缓冲液到底该用哪个配方好呢?是Tris-base 5.8g 甘氨酸 2.9g 甲醇 200ml SDS 0.37g呢还是甘氨酸 3g Tris 14.4g SDS 1g 甲醇 200ml 加蒸馏水至 1000ml呢?
第二个:TBST中加0.1%的Tween-20呢还是0.05%的Tween-20呢?

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1、转移缓冲液分湿转与半干转，两者是有区别的。你的第一个配方是半干的，第二个是时装的
2、Tween-20两者均可选
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发表于 2013-3-2 15:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
非常感谢你的回答！！
我做的是TIMP2，大鼠的，SantaCruz的抗体标记的是21KD，BIOworld抗体标记在34-26之间，所以一并问了！
BIO-BAD的半干转膜仪，连接的是BIO-BAD自家的PowerPac HC Power Supply电源，设置恒压的较为方便，再请教一下，恒压转膜条件？？
胶面积较小，设置恒流的话，计算出来只有20几个mA ,而电源设置选项上只有A单位，只能精确到0.01A，所以设置条件不准确！如何解决？
还有一个问题，最近是新鲜配制的丙烯酰胺，若是这个不准确的话，会有什么样的影响？？
谢谢~~~

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1、恒压我没做过，不好意思
2、丙烯酰胺怎么会不准确？
3、电流大点小点可以调整啊
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utt0989[使用道具]
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发表于 2013-3-2 15:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你好，我现在有个问题急需请教：
本来western条件挺稳定的，前几天实验室里九月份配的Acr-Bis用完了，师兄做的时候临时用的以前买的碧云天的成品，跑浓缩胶时发现条带不压缩，曝光发现条带很粗。当天我也做了一次情况相同。我们怀疑是Acr-Bis的问题，第二天重新配制，昨天我们两个各自重复一遍，发现问题仍没解决，仔细观察发现跑浓缩胶时条带不压缩，marker有分开，进入分离胶慢慢的却看到溴酚蓝略变窄，曝光后条带仍很粗。
这两三个月基本上每天都有人做western，除了Acr-Bis其它配胶的东西都没换。
感谢回答！
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wmp1234[使用道具]
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 小中大
请问制胶的时候胶老是不凝最常见的是什么问题？已经排除过硫酸铵。
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