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你好，我刚刚开始跑western，用RIPA提的总蛋白，BCA法测定在5ug/ul左右，上样50ug，8%分离胶电泳，恒压110V电转NC膜，配方是tris3g，甘氨酸14.4，甲醇200ml，定容1000ml，marker非常清晰，然后5%牛奶封闭RT2h，一抗1;1000 4°过夜，二抗1：2000 RT1h，然后用碧云天的ECL孵育曝光。36KD的GAPDH加上ECL后很快产生荧光，但是用保鲜膜包裹后发现荧光变弱。同样操作条件下，GAPDH的条带很强，10s就可以，但是56KD，120KD，142KD的目的蛋白从来没出现过（即使曝光10min也没有条带，56KD的曾用Thermo的发光液出现过一次，但是不太好）。
问题：
1.抗体浓度太低会不出现条带，而太高也会没条带吗？
2.发光液对结果影响很大吗？对于难检测的蛋白是不是灵敏度越高越好（比如GE Advanced ECL）？
3.孵育1抗2抗的时候，用的是铝制小盒，会不会对蛋白造成影响？
4.某个发光液的说明书上说，曝光可以长达1~10h，对于表达量很低的蛋白可以很好的显影，这样说有没有道理？
5.一抗是鼠单抗的，写着抗“哺乳动物”或“未在其他物种测试过”，除了可以用在人的蛋白检测之外，是否可以用在其他物种？比如，兔？
6，对于100KD以上的蛋白，电转时可否用乙醇代替甲醇？延长电转时间是否会效果好点？是否有更好的电转液配方适合100KD以上的大蛋白？
7.如何避免ECL荧光的迅速淬灭？
谢谢
