蛋白质与蛋白组学

1.mTOR（250KD左右）和p21 半干转（PVDF膜）的转膜条件，每平方厘米XX毫安是要根据膜的大小计算一下电流值吗，例如1*5cm 要多大电流？
2.如果转膜时间长，pvdf膜甲醇激活多长时间合适，滤纸可以多垫几层吗？
3.分离胶mtor用8%，p21 用12%（还是用15%好些？）可以吗？
4.未染marker 丽春红染色能看否看见
5.Abcam如何搜目的蛋白的cellular location

谢谢！！！

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1：电流 1.2*1*5
2：Millipore的PVDF膜 10s
3：可以
4：一般情况下能看见条带，条带看见与否取决于转膜效果与marker单条带蛋白浓度
5：在每个抗体说明中均有

你好，我刚刚开始跑western，用RIPA提的总蛋白，BCA法测定在5ug/ul左右，上样50ug，8%分离胶电泳，恒压110V电转NC膜，配方是tris3g，甘氨酸14.4，甲醇200ml，定容1000ml，marker非常清晰，然后5%牛奶封闭RT2h，一抗1;1000 4°过夜，二抗1：2000 RT1h，然后用碧云天的ECL孵育曝光。36KD的GAPDH加上ECL后很快产生荧光，但是用保鲜膜包裹后发现荧光变弱。同样操作条件下，GAPDH的条带很强，10s就可以，但是56KD，120KD，142KD的目的蛋白从来没出现过（即使曝光10min也没有条带，56KD的曾用Thermo的发光液出现过一次，但是不太好）。
问题：
1.抗体浓度太低会不出现条带，而太高也会没条带吗？
2.发光液对结果影响很大吗？对于难检测的蛋白是不是灵敏度越高越好（比如GE Advanced ECL）？
3.孵育1抗2抗的时候，用的是铝制小盒，会不会对蛋白造成影响？
4.某个发光液的说明书上说，曝光可以长达1~10h，对于表达量很低的蛋白可以很好的显影，这样说有没有道理？
5.一抗是鼠单抗的，写着抗“哺乳动物”或“未在其他物种测试过”，除了可以用在人的蛋白检测之外，是否可以用在其他物种？比如，兔？
6，对于100KD以上的蛋白，电转时可否用乙醇代替甲醇？延长电转时间是否会效果好点？是否有更好的电转液配方适合100KD以上的大蛋白？
7.如何避免ECL荧光的迅速淬灭？
谢谢

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1，太高有时候也不出，不知道如何解释
2，影响很大，不是越高越好，敏感性要合适
3，建议用塑料的
4，呵呵，我个人认为曝光超过10min就没有意义了
5，要通过你的预实验验证，如果抗体说明书没有标明还是别随便用
6，我都是用甲醇的，你的配方是湿转的，建议300mA 恒流 100K蛋白用时2h，注意降温
7，膜污染，二抗浓度太高都可能造成ECL荧光淬灭

老师，你好。最近做SRC1 ABCAM的抗体 上面介绍的 SRC1的分子量为160 但是说条带出现在200处 这是什么原因啊 做这个大分子量的蛋白 条件是什么啊 转膜液有什么要求 谢谢！

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160与200K本身在胶上就不能清楚的分辨
如果在160K处条带非常特异，没有杂带
我认为这就是结果没有问题