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标题:【讨论帖】western blot问题解答

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发表于 2013-3-2 16:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢斑竹的指点，因为染胶后不能进行下续实验故没做，下次试试看。
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am10[使用道具]
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发表于 2013-3-2 16:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
蛋白样品加了Loading Buffer、煮沸后放冰箱，每次操作时，是混匀样品后上样，还是吸取上清液上样？
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发表于 2013-3-2 16:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你好，我是新手，想做癌症标本的WB，能不能介绍一下标本取材的注意事项，特别是我们实验室没有小的液氮罐，有没有什么别的容器可以替代？因为不可能把那个大的液氮罐天天往手术室里抱，而标本不是要求离休30分钟内就要泡入液氮嘛

===================================================

取材后用锡纸包上、完成后尽快冻入液氮或者放入-80度保存
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发表于 2013-3-2 16:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
蛋白样品加了Loading Buffer、煮沸后放冰箱，每次操作时，是混匀样品后上样，还是吸取上清液上样？

====================

建议变性后充分混匀
分装
每次拿一小管
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发表于 2013-3-2 16:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
首先非常感谢版主的点拨！
再问问半干转膜时候，做三明治结构时赶气泡的技巧？
最近几次曝光后都发现有条带中间显影弱，貌似气泡的影响.....
如何避免滤纸、膜、胶三者之间的气泡？
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发表于 2013-3-2 16:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我在做有关NADPH氧化酶的亚单位p40的western, 目标条带并未出现在40KD附近,而是出现在55-70KD附近,请问这是怎么回事?请各位高手帮帮忙!
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发表于 2013-3-2 16:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

相关疾病：
水疱
您好：
请教个问题，我做WESTERN 有段时间了，是提心肌组织的蛋白，前几个月做的内参很漂亮。现在内参有，但很模糊，就象被水泡模糊的样子，有时就不出了，可是同时上样的心肌细胞的内参和目的就很漂亮，心肌细胞用的裂解液（ 碧云天（强）和碧云天的PMSF ）和我的心肌组织是相同的裂解液。 唯一不同的就是我的是心肌组织，后来怀疑是不是裂解液有问题。心肌组织是新做的模型，-80度保存。用了新的裂解液还是老样子。真不知道咋么回事？
弄了三个月了 ， 这个问题就是不知道怎么回事？ 万分着急，谢谢！
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avi317[使用道具]
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发表于 2013-3-2 16:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
就我的western杂交结果像您请教。
我做的材料是草莓果实，蛋白上样量30微克。目的蛋白26 kDa左右。12%浓缩胶，3%分离胶跑完后100毫安恒流转5h，膜是PVDF膜，4度封闭过夜，然后室温封闭2 h，一抗为通过原核表达，免疫兔子，兔血清纯化的多克隆抗体，浓度1比2500，室温反应3 h，TBST洗膜3次/10 min，二抗为promega羊抗兔HRP，浓度1比5000，室温反应2h，而后TBST2和TBS各洗3次，每次10 min，最后用普利莱的超敏发光液孵育3 min，压片1 min，曝光后什么条带都看不到（见附件图片）。
版主帮我分析下啥原因，是不是一抗和二抗的浓度高了？
多谢！
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pengke1983[使用道具]
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发表于 2013-3-2 16:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

补充：请问我这个有可能是蛋白提取的不好吗？
心肌组织取出后，马上投入到冰生理盐水中洗去血液，后用刀片切成小块，液氮冻存，后转到-80度冰箱中。
提蛋白时用的是碧云天（强）和碧云天的PMSF 100:1加的，液氮低温研磨后加入裂解液和PMSF混合液，大概100mg心肌组织加400微升上述裂解夜。混匀后冰上40分钟，12000转离心20分钟，取上清，加入loading buffer，95 10min变性。
请问下一步我该怎么办，是否需要换裂解液，是换成裂解力度不太强的吗，裂解力度太强是否也不好呢 ，请问老师，心肌组织的膜蛋白裂解，用碧云天的哪个类型的裂解液好呢？
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发表于 2013-3-2 16:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我做western blot的时候杂带特别多，但是不知道是什么原因，还有刚处理的样品，曝光之后actin的条带位置不对。希望多多指教，O(∩_∩)O谢谢！
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