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标题:【讨论帖】western blot问题解答

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发表于 2013-1-19 17:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我们用的博彩生物的RIPA
原本是用一半量的裂解液，但是跑出来的条带每次都很难看
后来就用全量的，就是0.01g组织用100ul的裂解液，之前一直是0.01g用50ul的
浓度自然比以前的少一半，然后定量后，最小的浓度就是3.5mg
提取完之后，没有立即蛋白定量，-20放了三天后等第二批才定量不知道有没有影响
裂解液没有换过，一直用的这个，而且以前测浓度也是7mg~10mg左右

====================================================

不会有太大的影响
我觉得你前后时间长了可以考虑一下整个系统里面的一些试剂的改变
这个很重要
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发表于 2013-1-19 17:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我写错了 是10MA 我用的是0.8MA每平方厘米膜面积
您建议的是用价钱贵一点膜是吗
我做的是SURVIVIN,但是我查不到它的丰度，楼主能否告知 不胜感激

===============================

不好意思
膜的孔径用0.2um的
比正常的0.45um孔径膜要稍贵一点
另外survivin的丰度不是很大
先查已经发表的文献
看他们用什么裂解液提取蛋白来做WB
good luck
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发表于 2013-1-19 17:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我想知道提取动物蛋白一般的浓度是多少呢？用UV计测OD用来计算浓度的时候最好稀释了再测才能符合线性关系是吗？还是影响不大？谢谢！
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发表于 2013-1-19 17:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问一下，我准备做PKC通道检测，是用WESTERNBLOT测含量好还是单单测活性好，两者有什么区别？谢谢！
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发表于 2013-1-19 17:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我想知道提取动物蛋白一般的浓度是多少呢？用UV计测OD用来计算浓度的时候最好稀释了再测才能符合线性关系是吗？还是影响不大？谢谢！

=========================

大鼠的做的比较多
肌组织一般在15~20mg/ml
总蛋白用UV测误差很大
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发表于 2013-1-19 17:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问一下，我准备做PKC通道检测，是用WESTERNBLOT测含量好还是单单测活性好，两者有什么区别？谢谢！

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这个我就不懂了
WB可以测定PKC的表达量
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发表于 2013-1-19 17:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
不会有太大的影响
我觉得你前后时间长了可以考虑一下整个系统里面的一些试剂的改变
这个很重要

、、、、、、、、、、、、、、、、

能不能说下大概哪些试剂改变下？
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发表于 2013-1-19 17:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

现在要做western，制作胶过程出了点问题，1堆积胶不凝，2胶特别粘，黏在两侧玻璃班上不好分开。目前已经重新配了所有液体，我们实验室之前做得还行，配方没变。改变了AP和TEMED的浓度也没变化。请指教
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 小中大
能不能说下大概哪些试剂改变下？

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那些试剂改变只有你知道啊
如tris-hcl及其ph
glycine
sds
都有可能会有影响的
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 小中大
现在要做western，制作胶过程出了点问题，1堆积胶不凝，2胶特别粘，黏在两侧玻璃班上不好分开。目前已经重新配了所有液体，我们实验室之前做得还行，配方没变。改变了AP和TEMED的浓度也没变化。请指教

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