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标题:【讨论帖】western blot问题解答

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发表于 2013-3-2 16:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

版主你好，我想请问一下，WB洗膜怎样才能洗的彻底又不会让蛋白损失太多，做出的结果又可用？
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发表于 2013-3-2 16:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问分子量很小的蛋白质，2KD左右，能用westernbloting检测吗？能检测出来吗？
不可以的话，该用什么方法啊？
我只要知道该蛋白质有没有表达就可以。谢谢！
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发表于 2013-3-2 16:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

没注意把4度保存的抗体放到-20度了，第二天发现后重新放回到4度，请问抗体会不会失效，或者抗体的效价会不会受到影响？
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发表于 2013-3-2 16:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问版主，我最近做的iNOS和eNOS的蛋白表达，WB用的分离胶是10%，电泳和电转均是恒压，条件都为100v,90分钟；5%脱脂奶粉封闭2h，RT。一抗都是Abcam的多抗，4度过夜，预计分子量分别为131kDa,135kDa，但ECL曝光出来条带位置均在55kDa左右，不知道问题出在哪？
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发表于 2013-3-2 16:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
取材后用锡纸包上、完成后尽快冻入液氮或者放入-80度保存

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谢谢，我想再问一下，您所谓的这个锡纸就商场卖的那种就可以吗，要不要特殊处理的？
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发表于 2013-3-2 16:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我是新手，最近开始做western，过程如下：1.年前提取的脑组织蛋白，测浓度1-2mg/ml，制成样品后于-20度保存2.用碧云天配胶试剂盒配12%分离胶，上样25ul，电泳浓缩胶80v 30min
分离胶100v 1h30min3.转膜：目的31kd 250mA45min，膜孔径0.22 4.37度封闭90min(封闭液为5%脱脂奶粉) 5.一抗4度过夜（1：500，为abcam多克隆抗体）6.二抗37度90min(1:5000)7.碧云天ecl发光试剂盒。
问题如下：1.每次显色是条带下方均有杂带2.显色1-2min后出现粗、深条带
附图如下，期待您的解答！
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发表于 2013-3-2 16:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

各位老师，想向大家请教一个问题。我调取了肝细胞生长因子（HGF）A链的一段基因，编码大概20KD的蛋白，现在做western-blog，买了抗HGF，A链的一抗，分子量为69KD，请问，我在查看目的蛋白大小位置的时候，是出现20KD为阳性还是69KD为阳性啊？
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发表于 2013-3-2 16:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

各位老师，想向大家请教一个问题。我调取了肝细胞生长因子（HGF）A链的一段基因，编码大概20KD的蛋白，现在做western-blog，买了抗HGF，A链的一抗，分子量为69KD，请问，我在查看目的蛋白大小位置的时候，是出现20KD为阳性还是69KD为阳性啊？
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 小中大
各位高手，请教个问题
糖皮质激素受体属于磷酸化蛋白么？
另外我做了几次都没有出带，用的是小鼠脑组织，
santa cruz的单克隆抗体1：100-1:10000,我用的是1：200，
国产二抗是1：5000，actin出的还行就是目的出不来。
用的是12.5%的胶，80v分离胶 120v浓缩胶共2h，
转膜180ma 2h,
5%去脂奶粉封闭（TBST稀释）1h，
3%TBST稀释奶粉液体孵育一抗，TBST洗膜3次，每次10min，4度过夜，
第二天再摇1h，然后3%TBST稀释奶粉液体孵育二抗 1h，TBST洗膜3次，每次10min,
加显色液 显色5min，进暗室压片，actin能看到很亮的带，就是目的看不到条带，有的 时候压片20分钟能够看到压出条带。
请各位高手指点一下,出现这种结果的原因是什么？
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发表于 2013-3-2 16:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请教LZ一个问题：
我现在做的是核蛋白，66KD；步骤是：上样量50ug，12%的胶。转膜条件是350mA,70min,一抗2h，4℃过夜都试过，二抗1h，ECL发光。这个WB体系我做过很多次了，其他蛋白都没有出过问题。这个一抗我以前做过，也可以出来结果。现在换了一种蛋白做，我在膜上可以看到荧光，不止我一个人看到，但是就是压不出来条带，压片时间延长到20-30min也这是为什么？是胶片的问题，还是显影定影液的问题？请指点一下，不胜感激！
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