小中大老师您好，我是一边看您前面的解答一遍结合我的情况提问题，因此可能问题比较多，也组织的不好，请您见谅！
我最近做睾丸组织bax 21kd bcl-2 26kd蛋白，一直没做出来，请教。
制样时，一半的组织是-80℃保存半年后制样，一半的组织是新鲜组织-80℃保存一个星期后制样。将组织从-80℃拿出，取小块，称重，放入玻璃匀浆器，一般5-8分钟，然后加裂解液。
上海生工RIPA裂解液ii（PL006)，1:5加入，带有蛋白酶抑制剂，但没加PMSF，玻璃匀浆器冰上匀浆20次，冰上放置60min等起裂解。12000g×30min 4℃离心。上清上层有一层白色的物质，好像是油脂，取上清时没管它，吸到了就吸到了。
（注：问题同dxyjy wrote:另外，蛋白提取时有絮状物，14000rpm*60min或30min都不能沉淀下去。我是35mm的一瓶细胞加1ml RIPA和10ul PMSF，操作严格按说明书进行，提很多次了，都这样，别人也用同一瓶试剂，都没有这种情况，会不会是蛋白的问题导致了WB结果这样呢？）
BCA法测蛋白浓度为8-12微克/微升。分光光度计测量。
100微升分装-80℃保存，使用时拿出加上样缓冲液，100℃4min，4℃保存。一般使用4-5次。
上样量10微升。胶的厚度为0.75mm。
我一般用5%浓缩胶，12%分离胶，跑胶。
转膜缓冲液为：tris 3g 甘氨酸 14.5g 甲醇200ml 蒸馏水800ml
bio-rad basic机器。
PVDF膜。0.45孔径。
以下为摸条件时，转膜后胶考染图片。
转膜恒压25V，电流35-43mA。在转移缓冲液中平衡15-30min。由于没有海绵，三明治两边全用滤纸夹。
上排15%胶，从左至右转膜时间0min,40min，40min，60min。
下排12%胶，左至右转膜时间0min,20min，40min，60min。
膜丽春红染色后都有条带。
此后用一直用12%胶，25v左右，55min左右转膜。
3%BSA PBST封闭1h，其中吐温20含量 0.5%。
一抗为博士德兔抗大鼠的多抗稀释比例1：100稀释，（推荐稀释比例1:100-1：400）室温孵育2h，（5月份的室温）
PBST洗膜10min×3次。
博士德进口分装二抗1:2000或1：3000稀释，（推荐稀释比例1:3000-1:6000）
PBST洗膜10min×3次。
ECL曝光1min。吉泰买的thermo ECL。内参和hsp70滴上去10几秒就发光了。
bax无条带，bcl-2二抗1:2000稀释时出现4个条带，1:3000时无条带。图在下面。
用同样步骤，做actin、GAPDH内参，转膜时间加40min，其他相同，内参各做3次，曝光良好。
同样转膜电压调为40v，电流36mA转膜时间90min做HSP70也能做出来。actin、GAPDH，HSP70一抗二抗都来自博士德。
我自己总结认为可能的问题1、样品，可能要做的蛋白含量较低。
2、转膜时间，浏览园子里其他战友类似大小蛋白一般都用80-100v转膜1h，和我的和不一样。是不是由于胶的厚度不同导致的。
3、一抗问题，也许要换好的一抗。
呵呵，现在郁闷得很，希望你能帮我看看可能有什么问题。
谢谢！
=========================
要说几点
1、先把蛋白SDS-PAGE做好
2、用ECL检测二抗的稀释度
3、最后考虑一抗
