小中大老师您好！
最近做WB遇到很多问题，想请老师帮忙解答：
我做小鼠小肠H2AX 17kd和Ku70+ku80，之前用10%的胶，觉得ku70和80的两条带距离太近，H2AX的带又很粗而且连成线，后来改用15%的胶做H2Ax，8%的胶做ku70+ku80。蛋白浓度4ug/ul，上样量8-12ul都试过。电泳60V 30min，100V 45min，转膜用半干转，18V 30min，转ku时也用过20V 45min。一抗都是abcam的，H2Ax 1：1000，ku 1：600（推荐1：300-1000），二抗1：1000，抗体都用1%BSA-TBST稀释。
我的问题是这样的：
1.用8%的胶后ku就没做出来，其他条件都没变，近两次H2Ax也没条带了，丽春红染是有带的，但70、80分子量处一直都不明显。抗体一般会重复用3-4次，可以前用过1个月还能出条带的，大约5cm2大小的膜敷1.5ml抗体。是重复用抗体的原因吗？可以用10%的胶做ku吗？
2.actin曝光出的条带都像方括号一样连在一起，而且中间泳道条带粗，两边细，因为目的蛋白条带也是两边泳道的细，以至于不能确定是真的连actin表达量都低了还是电泳的原因。这和电泳槽电压有关吗？而且开始跑时内槽会缓慢漏液，漏一段时间就停了，我需要中途暂停补加电泳液。条带连线我也怀疑过上样量的问题，但ku蛋白的条带很细，我怕上样少了ku的做不出来，如果不在同一块胶上跑又怕结果不可靠。
3.H2AX有的表达比actin强很多，条带连线，有的很弱，上样量怎么控制呢？
4.转膜条件可以吗？H2AX的膜7.5*3cm大小，ku的7.5*2cm，是不是这样的条件对于ku的效果不太好？
5.在浓缩胶中跑大概10min左右时就会有一些样的溴酚蓝从孔下边的角漏出来，漏到浓缩胶和分离胶的界限为止，速度很快，而且并不沿泳道往正下方漏，而是随意的方向，漏的孔和样也是随机的，但都漏过，随着样进入分离胶后，那些漏出来的溴酚蓝也跟着一起被压入分离胶了。因为目的蛋白是核蛋白，我用的是RIPA裂解液，每次提蛋白时都会有胶状的DNA，我已经尽可能少吸DNA了，但是不能完全避免。这些漏出来的会不会是DNA在作怪呢？浓缩胶我一般会凝3h的，应该能凝好啊
另外附上曝光的图片，第一张是actin的，第二张是ku的，最后是H2AX的，希望老师能帮忙解答！谢谢！
==============================================================
1、8%的胶分离70-80效果要好于10%
2、重复3、4次，里面的BSA还没坏？
3、actin像括号是因为上样量太大，另外是转膜后抗体孵育不完全造成两边细
4、上样量控制的看预实验条带啊。。。
5、转膜我没用过恒压
