蛋白质与蛋白组学

您好，我这段时间一直在做WB，但是一直没有做好，所以想向您请教几个问题，还麻烦您能给予指导：
1，我的目的蛋白在50到65kb之间，我用的胶是12%，跑胶时的电压分别是：浓缩胶100v，分离胶80v，大概一个半小时跑完，我的这一步的问题是：我的蛋白marker跑胶之后，条带很淡，而在别人的电泳装置上，用我的marker，跑的却比较好，不知何故？
2，转膜：我用的半干转，我原来用的电流是35mA，1小时20分钟，现在用的是50mA,50min，一抗稀释比1:5000到10000，我的问题是：转膜时，我本来就很弱的蛋白marker条带，转到膜上更少，最后发光显影时，条带现在很弱。是不是我转膜的时间和电流不够啊，我想问楼主半干转时转膜的时间和电流多少为宜啊？
十分的感谢！

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1、配的胶也一样吗？
2、多大的膜？建议用1.2mA/平方厘米膜面积，恒流。转膜1h30mmin

老师，你好。请教下。我最近做了很多次。总是效果不好。我把我的条件说下
1.目的蛋白是HIF-a。130kd
2.浓缩胶的浓度为5%，分离胶为8%。胶的厚度为1mm。上样量为30ul
3.浓缩胶时电压120V，分离胶180V.跑到最大的MARKER 170KD到分离胶后我就停了，大约为210min
4.转膜是湿转，膜为PVDF（孔径不太清楚，好像是0.2的）用的BIO-RAD transfer，300mA横流转250min.
5.封闭液为5%的脱脂奶粉，37°封闭2h
6.一抗为SIGMA的，用TBST稀释，1:200. 4°过夜
7.二抗是SIGMA的，用TBST稀释，1:200，37°2个小时
8.显影液为碧云天的ECL。显影时间为1min
9.每次洗涤用TBST 3*10MIN
10.抗体是重复使用的（我老板告诉我，他在美国的实验室一抗可以用3个月、二抗可以用一个月，所以只能重复使用啦）
出现的问题是
1.在MARKER 130KD处的那个条带很模糊或者看不到，在75KD左右出现2条带，这两条带很浓密而且每条都连成一条线。
2.背景很高，有时候刚好把条带遮住，我相当的郁闷。
3.降低二抗的浓度，有可能显影后没有条带

我想问的问题：
1.为什么 130KD处的那个条带很模糊或者看不到，在75KD左右出现2条带，这两条带很浓密而且每条都连成一条线？是弥散还是甚么问题？
2.湿转何如知道多少分子量要用多少的电流转多久？
3.湿转是不是很容易使蛋白弥散？
4.如何调整抗体的浓度及比例？
5.对ECL如何使用才能得到好的结果？

麻烦老师帮我解答下。万分感谢！

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1、连在一起时蛋白上样量大
2、湿转，1mm厚度胶，恒流，300mA，2h至2h30min
3、不容易弥散
4、稀释抗体用封闭液
5、ECl的使用比较麻烦，你得慢慢摸索。均匀孵育后曝光时间的掌握比较麻烦

请问下老师。一抗、二抗孵育时间多久最好，一抗我一般都是用4°过夜的，但在室温下孵育6个小时经常没有结果。二抗有的说不超过1小时，有的说不超过2个小时，这个我也不清楚。是不是二抗浓度过高会使背景太高？我看网上说二抗浓度可以用的1：1500以上，但是我用二抗1:500基本上都没条带啦。是我显影有问题还是二抗的问题呢？谢谢老师帮我解答下，万分感谢

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1、一抗请不要在室温孵育6h，4度过夜可以
2、二抗30-40min足够
3、我用的二抗稀释度1:10000-50000，不同的二抗不一样，不要一概而言
不同厂家，不同来源，不同ECL对一抗、二抗稀释度都是不同的

有关Western blot的问题请提问
我会及时给大家解答

希望大家提问的时候尽量把问题说的详细一些

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版主您好，我现在在做一种细胞外基质糖蛋白versican，买过两种抗体st和ab的，一个是380kd，一个是70kd，试过不同的条件，做的时间也不短了，但是一直没有很好的阳性，偶尔出的话也是很不清楚，一直做得都是组织提的蛋白。
做过360kd的KI67，很容易就转出来了。一直怀疑是抗体的问题，70kd的抗体在09年nature上的文章中用过，结果很好，您能不能给我提点建议呢？比如说在转膜和组织蛋白提取方面，其实我觉得可能这两个环节可能对我的制约很大，蛋白提取我一直都是用的超声破碎组织（4度 30J）。谢谢！