蛋白质与蛋白组学

老师，您好！
做western blot有段时间了，现在出现了一个让我非常疑惑的事情，就是我的目的条带非常好，上样40微克，但是内参actin却基本上没有，有的居然还有两条actin条带，我买的是进口的actin，之前做的是actin非常粗但是现在却做不出来，请老师给点建议！谢谢！

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如果操作没有问题
请考虑抗体
比如保存条件是不是符合厂家要求、能不能识别你的样品种属、冻融了多少次、污染等

版主您好，我现在在做一种细胞外基质糖蛋白versican，买过两种抗体st和ab的，一个是380kd，一个是70kd，试过不同的条件，做的时间也不短了，但是一直没有很好的阳性，偶尔出的话也是很不清楚，一直做得都是组织提的蛋白。
做过360kd的KI67，很容易就转出来了。一直怀疑是抗体的问题，70kd的抗体在09年nature上的文章中用过，结果很好，您能不能给我提点建议呢？比如说在转膜和组织蛋白提取方面，其实我觉得可能这两个环节可能对我的制约很大，蛋白提取我一直都是用的超声破碎组织（4度 30J）。谢谢！

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蛋白提取我一半不用超声
你是匀浆后超声还是只做超声提蛋白？

蛋白提取我一半不用超声
你是匀浆后超声还是只做超声提蛋白？

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我是取了肿瘤组织小块之后加裂解液，在裂解液里用小剪刀剪碎，而后再进行的超声破碎。因为我现在用的裂解液是RIPA，感觉裂解能力非常强（提细胞蛋白的话也需要进行超声，因为裂解后的液体都是粘稠的，应该是把核膜也裂解了核酸出来了吧！）。其实我也一直担心超声会不会把我的胞外基质蛋白降解了，搜了一些网上的方法看，大部分都没有用超声的。我提的蛋白做持家倒是没有什么问题，可能丰度太高吧！
最近重复做的WB，电泳用了4-7.5%的SDS-PAGE胶（380kd的蛋白），转膜液中含10%甲醇、0.1%SDS,300mA转了3h，一抗1:500，二抗1:3000，背景还可，就是条带是斑点状断续的。

我是取了肿瘤组织小块之后加裂解液，在裂解液里用小剪刀剪碎，而后再进行的超声破碎。因为我现在用的裂解液是RIPA，感觉裂解能力非常强（提细胞蛋白的话也需要进行超声，因为裂解后的液体都是粘稠的，应该是把核膜也裂解了核酸出来了吧！）。其实我也一直担心超声会不会把我的胞外基质蛋白降解了，搜了一些网上的方法看，大部分都没有用超声的。我提的蛋白做持家倒是没有什么问题，可能丰度太高吧！
最近重复做的WB，电泳用了4-7.5%的SDS-PAGE胶（380kd的蛋白），转膜液中含10%甲醇、0.1%SDS,300mA转了3h，一抗1:500，二抗1:3000，背景还可，就是条带是斑点状断续的。

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称取组织重量后，在冰上把组织剪碎
加入裂解液用电动匀浆器等匀浆，干嘛用超声？？？
如果提取出来的粘稠，可以用DNase I或者超声短暂处理一下
380K蛋白可以用梯度胶做

请问版主“灌好浓缩胶后1h拔除梳子，注意在拔除梳子时宜边加水边拔，以免有气泡进入梳孔使梳孔变形。拨出梳子后用ddH2O冲洗胶孔两遍以去除残胶，随后用0.1%的SDS封胶.”——0.1%的SDS封胶这是为什么？谢谢！

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我没这么做过
也没碰到过这样做的
说的是第一次，不好意思啦

称取组织重量后，在冰上把组织剪碎
加入裂解液用电动匀浆器等匀浆，干嘛用超声？？？
如果提取出来的粘稠，可以用DNase I或者超声短暂处理一下
380K蛋白可以用梯度胶做

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因为超声仪实验室就有，觉得方便就用了，我们这边好多人都用的超声，下次用匀浆试试！
组织量和裂解液的比例，您给提个建议吧！是不是裂解不完全也可以提蛋白，还是最好裂解澄清呢？
您所说的梯度胶是怎么个配法呢？
谢谢！

因为超声仪实验室就有，觉得方便就用了，我们这边好多人都用的超声，下次用匀浆试试！
组织量和裂解液的比例，您给提个建议吧！是不是裂解不完全也可以提蛋白，还是最好裂解澄清呢？
您所说的梯度胶是怎么个配法呢？
谢谢！

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梯度胶的配置参考《蛋白质技术手册》，有详细说明
一般情况组织重量：裂解液体积=1；9，常用
裂解不完全当然可以提取蛋白，只不过蛋白提取的量会少，或者部分不同部位的细胞提取少
离心后才能澄清啊