蛋白质与蛋白组学

称取组织重量后，在冰上把组织剪碎
加入裂解液用电动匀浆器等匀浆，干嘛用超声？？？
如果提取出来的粘稠，可以用DNase I或者超声短暂处理一下
380K蛋白可以用梯度胶做

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版主您好，匀浆的方法又提了蛋白，感觉还行，因为没有配梯度胶的仪器，还是用的4%浓缩胶和7.5%分离胶，但是380kd的versican还是做的不行，曝光要么有时能出带，但是感觉像是在点样孔的位置，因为我的浓缩胶基本上没切，只把竖条切了，怀疑是非特异；要么什么都没有。
曝完光之后，用立春红染了膜，虽然有带，但是好像是在点样孔以及浓缩胶与分离胶的界线处，是不是这些位置经常会出非特异的带呢？谢谢
还有一个小问题：转膜的时候选择稳压或者稳流有什么区别么？在什么情况下选择什么条件呢？谢谢

1.我们做western的重复性都很好，很稳定，但是我相信只要是实验条件一样的话，应该是经得起重复的。
2.关于跑胶的问题，本实验室的条件是先100伏跑十分钟，然后加大电压到160，一直跑到底。这样做的目的是使sample跑胶时在同一水平。还有就是sample之间蛋白量要严格一致，这点要注意。

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谢谢你的答复

1.我的WB的条件没有变动过，每次都按一样的条件进行的，而且做的过程中也仔细观察，就是为了防止出现什么意外；
2.我们实验室WB跑胶一直用的是恒流的方法，20mA跑10min左右，然后25mA到底这样子的

版主您好，匀浆的方法又提了蛋白，感觉还行，因为没有配梯度胶的仪器，还是用的4%浓缩胶和7.5%分离胶，但是380kd的versican还是做的不行，曝光要么有时能出带，但是感觉像是在点样孔的位置，因为我的浓缩胶基本上没切，只把竖条切了，怀疑是非特异；要么什么都没有。
曝完光之后，用立春红染了膜，虽然有带，但是好像是在点样孔以及浓缩胶与分离胶的界线处，是不是这些位置经常会出非特异的带呢？谢谢
还有一个小问题：转膜的时候选择稳压或者稳流有什么区别么？在什么情况下选择什么条件呢？谢谢

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找到了：
“鬼带”就是在跑大分子构象复杂的蛋白质分子时，常会出现在泳道顶端（有时在浓缩胶中）的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀，主要由于还原剂在加热的过程中被氧化而失去活性，致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合，聚合成大分子，其分子量要比目标条带大，有时不能进入分离胶。但它却与目标条带有相同的免疫学活性，在WB反应中可见其能与目标条带对应的抗体作用。
处理办法：在加热煮沸后，再添加适量的DTT或Beta巯基乙醇，以补充不足的还原剂；或可加适量EDTA来阻止还原剂的氧化。

版主您好，匀浆的方法又提了蛋白，感觉还行，因为没有配梯度胶的仪器，还是用的4%浓缩胶和7.5%分离胶，但是380kd的versican还是做的不行，曝光要么有时能出带，但是感觉像是在点样孔的位置，因为我的浓缩胶基本上没切，只把竖条切了，怀疑是非特异；要么什么都没有。
曝完光之后，用立春红染了膜，虽然有带，但是好像是在点样孔以及浓缩胶与分离胶的界线处，是不是这些位置经常会出非特异的带呢？谢谢
还有一个小问题：转膜的时候选择稳压或者稳流有什么区别么？在什么情况下选择什么条件呢？谢谢

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1、7.5%的胶marker你跑到什么位置？
2、最好把浓缩胶切掉
3、稳压与稳流都有人采用，我用稳流，取决于实验室及个人的习惯

您好，请教个问题
我要跑凋亡相关的蛋白，提取细胞蛋白时一定要收集漂浮细胞吗？
原先做时都是去上清，pbs洗后，加裂解液用刮刀刮的

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贴壁还是悬浮细胞？