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标题:【讨论帖】western blot问题解答

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相关疾病:
糖尿病
我想请教一下
我做的糖尿病系膜细胞提取的蛋白
分成4组,分别作内参和目的

目的是p47一抗1:100配置,二抗抗小鼠是1:5000配置,按说我的一抗已经浓度很高了,而且转膜2小时后,丽春红染色显示转上膜了,然后一抗摇床上均匀孵育1小时4°过夜,第二天TBST洗3次,每次10分钟,加2抗孵育1小时后TBST同样洗3次,每次10分钟,去曝片,结果,内参条带很浓,目的什么都没有,居然是一片空白

不知道是为什么……
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jujuba[使用道具]
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糖尿病


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我想请教一下
我做的糖尿病系膜细胞提取的蛋白
分成4组,分别作内参和目的

目的是p47一抗1:100配置,二抗抗小鼠是1:5000配置,按说我的一抗已经浓度很高了,而且转膜2小时后,丽春红染色显示转上膜了,然后一抗摇床上均匀孵育1小时4°过夜,第二天TBST洗3次,每次10分钟,加2抗孵育1小时后TBST同样洗3次,每次10分钟,去曝片,结果,内参条带很浓,目的什么都没有,居然是一片空白

不知道是为什么……

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换抗体稀释液配方;
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在线求助:55kD和43KD大小的蛋白转膜条件?
目前用200mA转1小时,但是,每次Marker都模糊甚至看不见了!
谢谢!

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200mA恒流,1h30min足够了
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我想请教一下
我做的糖尿病系膜细胞提取的蛋白
分成4组,分别作内参和目的

目的是p47一抗1:100配置,二抗抗小鼠是1:5000配置,按说我的一抗已经浓度很高了,而且转膜2小时后,丽春红染色显示转上膜了,然后一抗摇床上均匀孵育1小时4°过夜,第二天TBST洗3次,每次10分钟,加2抗孵育1小时后TBST同样洗3次,每次10分钟,去曝片,结果,内参条带很浓,目的什么都没有,居然是一片空白

不知道是为什么……

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什么公司的一抗?用1:100?
上样量多少?分子量是47吗?
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kuohao17[使用道具]
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55kD和43KD大小的蛋白转膜条件?
目前用200mA转1小时,但是,每次Marker都模糊甚至看不见了!
谢谢!

200mA恒流,1h30min足够了

方老师,这个条件会不会有点过了?
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wmp1234[使用道具]
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内参的问题和目的蛋白应该是一样的吧。中央发白的区域是不是蛋白和一抗二抗所在的区域,是不是过多的酶把底物消耗完的缘故?
还有个问题,压片的时候要把PVDF膜放到两层塑料膜间,而我合上塑料膜的时候,发现一些本来发光的区域不发光了,是不是合上薄膜时ECL流动到了别的地方?怎么样操作才能保证压片时的效果和从ECL中取出时的效果一样?
今天把一抗,二抗的稀释度都翻了一番,变成1:1000,1:4000。试了santa 的ECL,结果还是一样。
RT干燥是routin 干燥?怎么操作?

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似乎是荧光淬灭,可能抗体浓度过大或者有金属污染
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wood533[使用道具]
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老师,我今天第1次做western blotting,以前从没做过。
问个菜鸟级别的问题。
在制作悬浮淋巴细胞的蛋白样本时。
我们已经测得3个管的细胞数:
control组(无药物):2.5×10^7.
A浓度药物组: 2.2×10^7.
B浓度药物组: 1.8×10^7.
这时我们另外用Tris Glycine SDS Sample Buffer(2×)+ 蒸馏水配制裂解缓冲液,放在另3个小管中。
control组(无药物):Tris Glycine SDS Sample Buffer(2×)250ul+ 蒸馏水 250ul(共500ul)
A浓度药物组: Tris Glycine SDS Sample Buffer(2×)220ul+ 蒸馏水 220ul(共440ul).
B浓度药物组: Tris Glycine SDS Sample Buffer(2×)180ul+ 蒸馏水 180ul(共360ul).
一个小问题,裂解缓冲液加多少量合适。
我看到文献都是加一样多的裂解缓冲液,那我是按照细胞多少加的,比如control组500ul;
A浓度药物组共440ul,B浓度药物组360ul.
可以嘛?
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一般按照1×10的7次细胞加入1ml裂解液
依据不同细胞大小加的裂解液量可以从500ul-1ml
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相关疾病:
糖尿病
云之小雅 wrote:
我想请教一下
我做的糖尿病系膜细胞提取的蛋白
分成4组,分别作内参和目的

目的是p47一抗1:100配置,二抗抗小鼠是1:5000配置,按说我的一抗已经浓度很高了,而且转膜2小时后,丽春红染色显示转上膜了,然后一抗摇床上均匀孵育1小时4°过夜,第二天TBST洗3次,每次10分钟,加2抗孵育1小时后TBST同样洗3次,每次10分钟,去曝片,结果,内参条带很浓,目的什么都没有,居然是一片空白

不知道是为什么……

什么公司的一抗?用1:100?
上样量多少?分子量是47吗?

一抗是1:100用脱脂牛奶配的封闭液稀释配置的
上样量是20微升,分子量是P47
内参很清楚,目的什么都没有。我拿的是师姐提取的细胞做的,她也做不出来,说可能是提取细胞的方法就是做不出来P47,我用的是肾脏系膜细胞,应该p47表达的很高。
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yjf1026[使用道具]
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请教—有谁知道quantity one 最后用哪个结果比较?是Adj.Vol这个值还是Density这个值?
谢谢!
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