蛋白质与蛋白组学

一抗是小鼠单抗
二抗是兔？

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二抗是 Rabbit polyclonal to Mouse IgG-H&L(HRP), abcam.

有问题吗？

二抗是 Rabbit polyclonal to Mouse IgG-H&L(HRP), abcam.

有问题吗？

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没问题
一抗只做过1:1500这个一个稀释度？
如果是，先试下1:3000,1:5000稀释

请教您个问题。昨天我重新配置了12%的分离胶，其中更换的东西有1.5M tris-hcl，这次我用的是新的aps，别的没变化，但是刚刚跑胶非常快，是正常时间的一半，结果溴酚蓝带早就跑没了，但是marker的位置还算正常，不得其解，急求赐教。谢谢

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电泳完成后染胶看结果

我一新手 我的蛋白分子量是90 加样蛋白量5微升 配1：2的sample buffer 电泳积层胶是半个小时100伏 分离胶 一个小时120伏 转膜100伏 3小时 完成后 考马斯染胶 基本蛋白也转膜 开始用5%milk封闭 一抗推荐1：500 我梯度做了几次后选择了1：4000 5%BSA稀释过夜 二抗国产 1 ：1000 TTBS稀释 最后显影条带似乎可以看到 但背景灰黑 考虑封闭不够 就第二次改用5%BSA 封闭 再曝光 条带都基本看不到了 是不是封闭过度了 下面应该怎么做啊

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封闭多长时间？
二抗只做过一个稀释度？
ECL是哪个公司的？

前半个月WB试验还好，最近半个月老是不出东西，调整过去调整过来，搞的现在连WB胶都配不好了，。情况如下：希望大家能够给点意见。
电泳蛋白80微克，80v，至看见marker红线（72kD），然后调至100v，电泳时间大约1.5h。附图。
电转用250v，3h，三层夹心，滤纸上下各只铺了一层，湿转，NC膜，0.45微米。目的分子量150kd。转后丽春红染膜，（附图），考马染电转过的胶条仍发现有两孔少许蛋白未转至膜上。
TBS洗涤后，10%脱脂奶粉封闭2h，室温，28度。TBST洗涤，10minx3次。加一抗1：1500以5%奶粉稀释抗体.（抗体2009-12-19到我手上，刚开始使用效果很好，达到1：5000。保存于-70度，分装使用）。二抗使用皮尔斯二抗，1：2000，5%奶粉稀释抗体。显影结果如图，显影未看见条带。

[ 本帖最后由 ROSE李 于 2013-3-7 20:37 编辑 ]

半个月WB试验还好，最近半个月老是不出东西，调整过去调整过来，搞的现在连WB胶都配不好了，。情况如下：希望大家能够给点意见。
电泳蛋白80微克，80v，至看见marker红线（72kD），然后调至100v，电泳时间大约1.5h。附图。
电转用250v，3h，三层夹心，滤纸上下各只铺了一层，湿转，NC膜，0.45微米。目的分子量150kd。转后丽春红染膜，（附图），考马染电转过的胶条仍发现有两孔少许蛋白未转至膜上。
TBS洗涤后，10%脱脂奶粉封闭2h，室温，28度。TBST洗涤，10minx3次。加一抗1：1500以5%奶粉稀释抗体.（抗体2009-12-19到我手上，刚开始使用效果很好，达到1：5000。保存于-70度，分装使用）。二抗使用皮尔斯二抗，1：2000，5%奶粉稀释抗体。显影结果如图，显影未看见条带。

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1、胶配不好与APS、TEMED、环境温度有关
2、什么蛋白？

没问题
一抗只做过1:1500这个一个稀释度？
如果是，先试下1:3000,1:5000稀释

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做过1:3000的稀释，条带就很淡。
还有，为什么会出现两头很粗的情况呢？