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标题:【讨论帖】western blot问题解答

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发表于 2013-3-8 17:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
小弟近日做一种分子量较大的蛋白（包含280/120KD 2个片段），文献提示为非还原变性，上样量为80ug，我尝试了6%及8%的胶，电转(湿转)60V 2.5h，快速封闭液0.5h，1抗(1:300)4度过夜，2抗(1:2000)1h。做了好几次都没有任何条带，而内参显示挺好的。不知各位大侠能否指导下，是否存在什么错误或不足？？？
PS：此外我用的Fermatas SM1841蛋白maker，在10孔1.5mm厚度加样20ul了，电泳后胶上显示挺好，但转膜后条带非常淡，很多还看不出来，这是为何啊？？？
非常感谢！

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你也用的文章中的条件？
抗体说明书也是检测非还原变性条件下的目的蛋白
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发表于 2013-3-8 17:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
求教--目的蛋白曝光时连成一条线，可能是怎样的原因？
已将二抗降低浓度，效果不佳！

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减低上样量
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发表于 2013-3-8 17:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
一抗是用封闭液配的,为啥还要洗呢?

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不洗当然也可以
有些时候孵育后的一抗要回收
洗洗会好一些
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发表于 2013-3-8 17:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
最近做了个抗血清的检测，50KD蛋白，电转(湿转)35V 3.5h，封闭液2，1抗(1:500)2h，2抗(1:20000)2h。阴性对照基本没有显色，阳性有好些条带。怎么会这样？麻烦解惑下，谢谢

阴性：BL21菌液 阳性：pET-gene-BL21诱导菌液

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一抗调整至1:1000，1:2000等试试
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发表于 2013-3-8 17:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我最近做Notch1蛋白，分子量125kDa，上样60ug，电泳条件：80V 30min，120V 50min；转膜条件：恒流400mA 2h；5%脱脂奶粉 室温封闭1h；Epitomics一抗(1：250）4°C孵育过夜，推荐1：1500.CST二抗1：3000室温孵育1h。北京普利莱的ECl发光液。
这个一抗效价并不是很好，但后面有做出来过。最近几次同样条件再做就出不来了。怀疑是转膜的问题，因为Maker在胶上还挺明显，但为什么转到膜上就很淡很淡了。再者，提取的蛋白样品会不会有问题啊？
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tianmei001[使用道具]
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发表于 2013-3-8 17:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

楼上的，预染Marker狠容易扩散的。你可以在相同的转膜条件下换成彩色Marker比较一下！
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发表于 2013-3-8 17:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
楼上的，预染Marker狠容易扩散的。你可以在相同的转膜条件下换成彩色Marker比较一下！

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我用的就是fermentas的sm0671
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发表于 2013-3-9 08:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
彩色marker也是预染的
两者有什么区别？
只不过是标记的染料不同而已
Epitomics的抗体基本上还是可以的
转膜用300mA 2h就够了
你是不是同一批蛋白样品反复冻融了之后上样的？
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发表于 2013-3-9 08:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
楼上：
蛋白样品反复冻融很容易降解是不是？
可是我就冻融过一两次而已，应该还是不至于吧。
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 小中大
冻融一两次没问题
蛋白在进行WB进行过电泳后的染胶吗？
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