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标题:【讨论帖】western blot问题解答

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发表于 2013-3-9 09:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

还是纤维蛋白原的问题，我的蛋白是工厂自己提出来的，制成了冻干粉，灌装。样品和上样缓冲液的比例问题，这蛋白是纯的，浓度要多少就可以是多少，我挺迷糊的，也不知道该上样多少ug能跑好（考染色后条带好），也不知道该加多少比例缓冲液。你看这样，我打算上样蛋白总量是20ug,然后纤维蛋白原溶成4mg/ml,取5ul的样，加上5ul的上样缓冲液，这样行否？
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发表于 2013-3-9 09:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请教：最近做了2次western，结果都是没有明显的斑点，而且整个片子呈白色，但是目标条带位置也发白，个人感觉这两个结果有些矛盾，与以往不同的有两个，一是配胶的tris溶液新配的，也许ph不准；而是洗膜用的是厂家赠送的tbs，不是原来的tbst溶液。别的都差不多，请问楼主有可能是以上的原因造成片子及斑点处发白吗？谢谢
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发表于 2013-3-9 09:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问GAPDH（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）和细胞骨架蛋白beta-actin或beta-tubulin内参在细胞损伤及药物干预的情况下会发生变化吗？谢谢！
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发表于 2013-3-9 09:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问高手，为什么有时候我做的western总是想“M”型的带呢，就像下面的图示。很奇怪一样的手法偶尔就有，但是大部分时间是没有的，请指教，谢谢！！


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发表于 2013-3-9 09:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
蛋白已经变性了，怎么再调整浓度，可以再加裂解液吗？该如何操作？

================

不好意思
这种没尝试过
你可以尝试一下
把结果挂上来
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发表于 2013-3-9 09:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你好！我抽提的是跨膜蛋白（跨膜3次），我如果用总蛋白抽提试剂盒，那所抽提的蛋白可以用么？

===================================

如果做WB完全可以
不知道你用什么牌子的裂解液提取的蛋白
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发表于 2013-3-9 09:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我的蛋白是Bcl-2/bax的……

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那个公司的一抗及ECL？
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发表于 2013-3-9 09:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
首先，谢谢版主！
纤维蛋白原跑电泳，分子量是340kd，我想跑完后考染色，考察他的分子量。能不能推荐一下，我浓缩胶、分离胶用多大的，还有电泳的条件，我以前做过细胞中的蛋白WB，一般都是80、120v（5%、12%）,分子量这么大，还用这个行么？
另外，还有一问题，这次采购买回来的十二烷基硫酸钠是粉针状的，商标写的是十二烷基硫酸钠（粉针），科密欧的，以前用的是细粉，我用不用换货呢？

===================

用7.5%或者8%
最好用4-12%梯度胶
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发表于 2013-3-9 09:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
还是纤维蛋白原的问题，我的蛋白是工厂自己提出来的，制成了冻干粉，灌装。样品和上样缓冲液的比例问题，这蛋白是纯的，浓度要多少就可以是多少，我挺迷糊的，也不知道该上样多少ug能跑好（考染色后条带好），也不知道该加多少比例缓冲液。你看这样，我打算上样蛋白总量是20ug,然后纤维蛋白原溶成4mg/ml,取5ul的样，加上5ul的上样缓冲液，这样行否？

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纯蛋白的话上样量0.1-0.5ug足够啦
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 小中大
请问GAPDH（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）和细胞骨架蛋白beta-actin或beta-tubulin内参在细胞损伤及药物干预的情况下会发生变化吗？谢谢！

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你觉得呢？
哪有绝对不变的东西呢？
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