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标题:【讨论帖】western blot问题解答

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发表于 2013-1-28 16:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

转膜条件基本可以
一抗与二抗浓度均较高
建议：先做二抗的稀释度（同时不同的ECL均需检测）
用点杂交
用1倍TBS或PBS稀释二抗
做不同的梯度
比如1：1000，1：2000，1：4000
稀释好后各取1ul点在NC膜上
RT干燥
加发光液
曝光
确定二抗的合适稀释度

下一步
做一抗的稀释度
一抗也可以做几个不同的稀释度来摸条件
转膜后把膜剪成小条，加不同的稀释度的一抗
孵育进行后续步骤

good luck
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发表于 2013-1-28 16:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=14125883&sty=1&tpg=1&age=0')

=====================

内参做成这样
说明操作上不是很严谨
或者说是整个步骤有问题
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发表于 2013-1-28 16:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

内参的问题和目的蛋白应该是一样的吧。中央发白的区域是不是蛋白和一抗二抗所在的区域，是不是过多的酶把底物消耗完的缘故？
还有个问题，压片的时候要把PVDF膜放到两层塑料膜间，而我合上塑料膜的时候，发现一些本来发光的区域不发光了，是不是合上薄膜时ECL流动到了别的地方？怎么样操作才能保证压片时的效果和从ECL中取出时的效果一样？
今天把一抗，二抗的稀释度都翻了一番，变成1：1000，1：4000。试了santa 的ECL，结果还是一样。
RT干燥是routin 干燥？怎么操作？
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发表于 2013-1-28 16:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你说的很有道理
二抗浓度高了HRP会把ECL中的底物消耗掉
在你加上ECL的时候会很亮
但是很快就会减弱了
首先要保证二抗的稀释度合适才行
才能保证压片时的效果

另外你为什么要干燥？

WB过程是要避免膜干燥的
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发表于 2013-1-28 16:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

还有就是在ECL孵育的过程中要避免金属等污染膜
会抑制HRP的活性
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发表于 2013-1-28 16:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

最近去暗室曝光的时候，涂上发光液后膜上有很亮的一些点，曝光后的胶片上就成了麻点，非常难看，请楼主帮忙分析一下是什么原因啊
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发表于 2013-1-28 16:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

建议重换洗膜、稀释抗体用的缓冲液
前几天有个战友也有类似情况
她的问题是这样的：同一个抗体
一个用抗血清、一个用纯化后的抗体
结果抗血清的片子干净，纯化后抗体的片子和你说的一样
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发表于 2013-1-28 16:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

最近做大分子200KD的蛋白，显色后条带不是窄条状的，而是沿着泳道散开成 一片，成竖带状的了，原因分析下
因为是200KD的，我用的6%的胶，电泳2个小时到溴芬兰出了胶停止的
以前有次用10的胶跑下来条带很漂亮，难道因为6的胶比较稀，蛋白压缩不好，电泳时间长了蛋白弥散开了？/？？

选择湿转了2次，300ma/2.5h，转完预染marker都不是很清楚，立春红也没看见，转膜液是tris 25mM,Gly 192mM,Met 20%,SDS 0.1%,加水到1L，正负绝对没错，三明治也没问题，只好换半干1.5h, 预染marker转过去了，结果显色后就是楼上那样，郁闷
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发表于 2013-1-28 16:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问做western-blot时，目的蛋白是膜蛋白，内参也应该是膜上组成性表达的蛋白吧，应该选什么呢？谢谢啦！
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发表于 2013-1-28 16:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
可能的问题在你做三明治的时候把胶压的太扁了
在300mA的电流下转缓是很热的
容易把胶压扁
我也出现过你说的这种条带情况
还要检查一下浓缩胶是否凝好
good luck
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