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标题:【讨论帖】western blot问题解答

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发表于 2013-3-9 10:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 windy+++ 于 2013-3-9 10:40 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
请问楼主：marker是蓝色的，相应pv膜被染蓝，ECL下会显色吗？

ECL能不能显色要看marker的原材料（蛋白）是什么
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windy+++[使用道具]
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发表于 2013-3-9 10:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
老师，你好。今天我跑内参，加了四个样本，结果只出现一条带，其他组没出现，你认为是什么原因那
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发表于 2013-3-9 10:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
楼主，你好！我用同一个样品使用nonreducing condition和reducing condition跑胶，跑出来后曝光，出来的条带不一样，请问这是什么原因啊？谢谢
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mimili_901[使用道具]
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发表于 2013-3-9 10:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

版主好，1.我做b-actin，150mA湿转，多长时间比较合适？
2.没有变性的蛋白在-20冰箱可以放多久？
3.我想用GAPDH做内参，可不可以在同一张膜上面直接做，具体如何操作？
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发表于 2013-3-9 10:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

楼主您好：几个问题请教
1，用碧云天RIPA裂解液（强），加PMSF裂解大鼠脑组织（未加其它蛋白酶抑制剂），测蛋白浓度后-70保存，核蛋白能否裂解出来？（按照说明书操作）
2，WB跑胶后，考马斯亮蓝染胶，目标蛋白附近有条带，但是未见明显趋势（应该有趋势），也未必就能说把核蛋白裂解出来了吧
3，今天跑胶，内参跑出来了，目标蛋白一点也没显影，一抗是Abcam的。

现在就怀疑蛋白裂解有问题，我的裂解液还应加入什么才能更好的裂解核蛋白呢？？（该裂解液说明书上写核蛋白裂解效果很好，蛋白酶抑制剂也有的）
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发表于 2013-3-9 10:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

另外：已经提完的蛋白液里会不会还有没裂解出来的核蛋白，能不能再提一次？
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发表于 2013-3-9 10:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我现在做的是52KD的蛋白，用10%是胶时，片子出来的结果是条带很松散，且不黑很浅，加大上样量背景又很少，若降低一抗浓度，又变得很浅。同时用12%的胶时，条带很细，也黑了。但是转膜后染胶，10%的可以完全转过去，12%的就会有很多没转过去，我的转膜条件是100V80-90分钟。我做了很多次都是这样，我觉得这样会很影响实验结果，现在都不知道该怎么再做下去了，麻烦老师帮忙给指导一下，谢谢！
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发表于 2013-3-9 11:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
老师您好，问个非技术问题。半个月前做过一次WB，当现在想做的时候发现凝胶贮液都变成胶状凝固的了，半个月前配胶时没有大的失误，不敢肯定是不是因为一些不记得的小失误如配胶时未更换枪头，但是配胶时所用的大枪头只用在凝胶贮液，缓冲液，DW上，所以不知道怎么就会变成这样了。凝胶贮液是刚买不久的。。。。。。望老师解答，谢谢
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发表于 2013-3-9 11:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
老师，你好。今天我跑内参，加了四个样本，结果只出现一条带，其他组没出现，你认为是什么原因那

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转膜后进行丽春红染色等步骤检测了吗？
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NBA[使用道具]
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发表于 2013-3-9 11:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
楼主，你好！我用同一个样品使用nonreducing condition和reducing condition跑胶，跑出来后曝光，出来的条带不一样，请问这是什么原因啊？谢谢

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什么蛋白？
reducing会打断二硫键，如果你的蛋白存在有二硫键的话，跑出来的分子量不一样是对的
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