蛋白质与蛋白组学

版主好，1.我做b-actin，150mA湿转，多长时间比较合适？
2.没有变性的蛋白在-20冰箱可以放多久？
3.我想用GAPDH做内参，可不可以在同一张膜上面直接做，具体如何操作？

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1、300mA 40min
2、可以放置几个月吧
3、可以做，方法有好几种，需要通过目的蛋白来确定。

楼主您好：几个问题请教
1，用碧云天RIPA裂解液（强），加PMSF裂解大鼠脑组织（未加其它蛋白酶抑制剂），测蛋白浓度后-70保存，核蛋白能否裂解出来？（按照说明书操作）
2，WB跑胶后，考马斯亮蓝染胶，目标蛋白附近有条带，但是未见明显趋势（应该有趋势），也未必就能说把核蛋白裂解出来了吧
3，今天跑胶，内参跑出来了，目标蛋白一点也没显影，一抗是Abcam的。

现在就怀疑蛋白裂解有问题，我的裂解液还应加入什么才能更好的裂解核蛋白呢？？（该裂解液说明书上写核蛋白裂解效果很好，蛋白酶抑制剂也有的）

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1、能裂解出一部分核蛋白
2、考染不能说明某一蛋白的问题，如果能说明的话就不需要做WB检测了。考染能看看蛋白提取与定量情况
3、上样量多少？ECL是什么？

另外：已经提完的蛋白液里会不会还有没裂解出来的核蛋白，能不能再提一次？

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剩下的是细胞碎片，建议用新样品提取

我现在做的是52KD的蛋白，用10%是胶时，片子出来的结果是条带很松散，且不黑很浅，加大上样量背景又很少，若降低一抗浓度，又变得很浅。同时用12%的胶时，条带很细，也黑了。但是转膜后染胶，10%的可以完全转过去，12%的就会有很多没转过去，我的转膜条件是100V80-90分钟。我做了很多次都是这样，我觉得这样会很影响实验结果，现在都不知道该怎么再做下去了，麻烦老师帮忙给指导一下，谢谢！

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配胶的一些缓冲液可能有问题
膜是新买的吗？

老师您好，问个非技术问题。半个月前做过一次WB，当现在想做的时候发现凝胶贮液都变成胶状凝固的了，半个月前配胶时没有大的失误，不敢肯定是不是因为一些不记得的小失误如配胶时未更换枪头，但是配胶时所用的大枪头只用在凝胶贮液，缓冲液，DW上，所以不知道怎么就会变成这样了。凝胶贮液是刚买不久的。。。。。。望老师解答，谢谢

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储液不能用了就换了吧

配胶的一些缓冲液可能有问题
膜是新买的吗？

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膜是新买的。我今天试试延长凝胶时间，加大上样量，看结果如何。
我用同样的胶做的别的蛋白就很好，而且我们实验室的其他人也用的一样的配胶溶液都很正常 。
另外还有一个问题要问您，我做的43KD的蛋白条带也有些弥散，有时候就像两个条带似地。
前段时间做的不这样的，现在不知道该怎么处理了，再麻烦老师知道一下。

什么蛋白？
reducing会打断二硫键，如果你的蛋白存在有二硫键的话，跑出来的分子量不一样是对的

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我做的是血清，我直接把血清拿来做的，没有去除里面的任何成分。我的蛋白是CFH

楼主您好：几个问题请教
1，用碧云天RIPA裂解液（强），加PMSF裂解大鼠脑组织（未加其它蛋白酶抑制剂），测蛋白浓度后-70保存，核蛋白能否裂解出来？（按照说明书操作）
2，WB跑胶后，考马斯亮蓝染胶，目标蛋白附近有条带，但是未见明显趋势（应该有趋势），也未必就能说把核蛋白裂解出来了吧
3，今天跑胶，内参跑出来了，目标蛋白一点也没显影，一抗是Abcam的。

现在就怀疑蛋白裂解有问题，我的裂解液还应加入什么才能更好的裂解核蛋白呢？？（该裂解液说明书上写核蛋白裂解效果很好，蛋白酶抑制剂也有的）

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1、能裂解出一部分核蛋白
2、考染不能说明某一蛋白的问题，如果能说明的话就不需要做WB检测了。考染能看看蛋白提取与定量情况
3、上样量多少？ECL是什么？

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上样量是20ug，16ug蛋白加4ug上样缓冲液（总蛋白浓度大约调为1ug/ul），现在怀疑上样量太少，最近打算提高上样量40ug，80ug，100ug分别跑电泳试试情况，另外一抗浓度也适当提高一点看看。
ECL是DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒

上样量是20ug，16ug蛋白加4ug上样缓冲液（总蛋白浓度大约调为1ug/ul），现在怀疑上样量太少，最近打算提高上样量40ug，80ug，100ug分别跑电泳试试情况，另外一抗浓度也适当提高一点看看。
ECL是DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒

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1、WB不需要那么高的上样量，我一般上样量不会超过40ug，BCA法蛋白定量
2、ECL是DAB辣根。。。。？
表述有误。
用DAB敏感性差，能做出结果来的可能性不大