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标题:【讨论帖】western blot问题解答

windy+++[使用道具]
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发表于 2013-3-9 11:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
楼主，接着想教你WB问题，我每次转膜都是转两张膜（在两个黑匣子里），用一个电转仪电转，每次照相都是一张膜显示，请问楼主这是什么原因那？？
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发表于 2013-3-9 11:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

还有个问题接着问哈楼主，上样的时候根据蛋白的浓度，计算上样体积从而使蛋白的量一致，我是这样做的，还有上样相同的体积，蛋白量不一样，然后根据浓度计算从而标准化，这两者那一种更好一点，楼主的经验是什么，谢谢！！
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qianqin1977[使用道具]
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发表于 2013-3-9 11:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

亲爱的战友们：我现在遇到一个奇怪的事情，麻烦楼主与战友们给我一些启示。
我现在做一个分子量17的蛋白，曝光后的结果是背景一片漆黑，在目的条带处包括MARKER的目的条带处是亮的。就是说结果和本来预想的恰恰相反！！！而且目的条带的形状很好，扁椭圆形，不同标本还可见粗细的不同，这种粗细的差异和预想一致！
我有些崩溃了！
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发表于 2013-3-9 11:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
接上，我的BETA曝的效果挺好的。同时电泳，同时转膜，同时曝光。
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发表于 2013-3-9 11:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

您好！我最近打算做药物对肾脏疾病NF-KB信号通路的干预作用，想用Western Blot测定NF-KB p65活性。一些国外的文献NF-KB p65活性测定采用的是普通的抗体，也有文献采用的是磷酸化的抗体，所以很不理解。园子的朋友说p65活化后入核，所以测核内普通的NF-KB p65活性与测蛋白的p-NF-KB p65活性意义是一样的，我想知道是不是这样？我是不是可以这么理解：NF-KB的活性可以通过活化的p65来反映，而p65只有活化后才能进入核内。换句话说，也就是p65的磷酸化水平可以反映核内p65的水平。那么是不是全蛋白中磷酸化的p65水平跟核蛋白中总的p65水平相一致？那么是不是可以用p-p65抗体测全蛋白中磷酸化的p65来反应NF-KB活化程度，而不一定要用普通的p65抗体测定核蛋白中p65的量？是不是这样？另外，我如果只想看下药物对NF-KB有没有影响的话是不是只要看干预组与对照组全蛋白中NF-KBp65的水平，而没必要一定要测核蛋白或者磷酸化p65的水平？请您指点！！谢谢！！！
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发表于 2013-3-9 11:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

楼主您好，我刚开始做wb，现在我遇到个问题就是我的目的蛋白是17，35KD的，内参是43KD,如果不洗的话，怎么在一块胶上同时检测，谢谢！
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发表于 2013-3-9 11:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

老师你好！有几个问题。
1.我今天跑了个GADPH（内参）。一个正常样本和四个不同时间感染的鼠肝脏组织来源的蛋白样本，跑了五个泳道。显影出来仅有正常组出现GD条带，而且又细又浅，其余四组影子也没有，请问会是什么原因啊！
整个操作在冰上进行，应该不会是蛋白降解。转膜条件是350mA 150min，有没有问题啊？
转膜完后胶染色，无条带。
2.还想问一下，转膜用的滤纸一般多长时间换一次？
3.天气凉了以后，用5%脱脂牛奶进行蛋白封闭需不需要提高温度，增加封闭效率？
辛苦啦！
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发表于 2013-3-9 11:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

楼主您好，我刚开始做wb，现在我遇到个问题就是我的目的蛋白是17，35KD的，内参是43KD,如果不洗的话，怎么在一块胶上同时检测，谢谢！

你的意思是这三个蛋白在同一块膜上检测吧。
这三个蛋白的分子量离得不是很近17,35,43kd，我觉得，可以在电泳中加上预染marker,转膜后，或者在封闭后，将这三个蛋白按marker上所显示蛋白质的分子量，将其剪成三块膜，分别孵不同的一抗，剪得时候要看好，以免碰到这三个蛋白条带。仅供参考！
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发表于 2013-3-9 11:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
最近想做western 对western还不是很了解 弱弱的问一下 如果用细胞做western是不是必须是活细胞啊？培养好后在冰箱冻存的细胞能不能做啊？谢谢

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冻存的细胞与组织都可以
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发表于 2013-3-9 11:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
还有个问题接着问哈楼主，上样的时候根据蛋白的浓度，计算上样体积从而使蛋白的量一致，我是这样做的，还有上样相同的体积，蛋白量不一样，然后根据浓度计算从而标准化，这两者那一种更好一点，楼主的经验是什么，谢谢！！

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