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标题:【讨论帖】western blot问题解答

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发表于 2013-3-9 14:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 BOSS2011 于 2013-3-9 14:44 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
前辈您好：请教您两问题，我配的8%的胶，蛋白分子量为100，50-57，18kD，转膜时我把胶切成两段，以35为界，18KD的转两小时，100及50-57转三小时，恒流300mA,湿转，NC膜，不知可否？刚才转完了，瞅了一眼，因为35以下的胶条很小了，所以不好固定，变形了 ...


用0.22um的膜一起转
不用切胶
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发表于 2013-3-9 14:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我想请教楼主一个问题
最近我做K562细胞内γ珠蛋白的检测，但是一直未有结果出来，不知为何，我做的条件：15的胶，转膜250mA，3h。可以清晰的看到Marker的最后一条10kd的条带在NC膜上，目的蛋白：γ珠蛋白的大小事18kd。最后加完ECL混合液，根本没有荧光显示，曝光也没有任何条带显示，不知道是什么原因。
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发表于 2013-3-9 14:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
用0.22um的膜一起转
不用切胶

=============================================================================================

再请问前辈一下，我用的就是0.22um的膜，如果一起转3小时，300mA，分子量为18KD的目的蛋白会不会转过头啊？
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发表于 2013-3-9 14:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

老师你好，我提的蛋白做出了目的蛋白，但是今天没有做出内参（贝塔-action），丽春红染膜膜上有蛋白，重新附了二抗仍然没有显影，请问老师1.是我蛋白没提取好吗？？？2.我放二抗的冰箱电源线前几天遭拔了一次（可能别人无疑碰掉的），你认为我二抗（我做二抗+ECL发光剂，暗室下看得到荧光，是不是说明二抗基本上没问题？？？）会不会受影响？？？3.老师认为下一步怎么做（贝塔-action没问题，因为我前几次提的蛋白都做出来过），谢谢指教，不胜感激！
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发表于 2013-3-9 14:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我想请教楼主一个问题
最近我做K562细胞内γ珠蛋白的检测，但是一直未有结果出来，不知为何，我做的条件：15的胶，转膜250mA，3h。可以清晰的看到Marker的最后一条10kd的条带在NC膜上，目的蛋白：γ珠蛋白的大小事18kd。最后加完ECL混合液，根本没有荧光显示，曝光也没有任何条带显示，不知道是什么原因。

==================================

用0.22um的膜
转膜250mA 20-30min
1、电泳后先染胶，确保有合适量的蛋白
2、丽春红染色验证转膜效率
3、抗体做不同的稀释度
4、验证二抗与ECL
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发表于 2013-3-9 14:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
再请问前辈一下，我用的就是0.22um的膜，如果一起转3小时，300mA，分子量为18KD的目的蛋白会不会转过头啊？

=========================

18K的转膜时间确实有点长
你不能分开做吗？
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发表于 2013-3-9 14:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
老师你好，我提的蛋白做出了目的蛋白，但是今天没有做出内参（贝塔-action），丽春红染膜膜上有蛋白，重新附了二抗仍然没有显影，请问老师1.是我蛋白没提取好吗？？？2.我放二抗的冰箱电源线前几天遭拔了一次（可能别人无疑碰掉的），你认为我二抗（我做二抗+ECL发光剂，暗室下看得到荧光，是不是说明二抗基本上没问题？？？）会不会受影响？？？3.老师认为下一步怎么做（贝塔-action没问题，因为我前几次提的蛋白都做出来过），谢谢指教，不胜感激！！！！！！

==============================

用回收的beta-actin抗体？
把蛋白或者抗体的名字拼写正确！
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发表于 2013-3-9 14:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
不是用的回收的beta-action抗体，beta-action抗体是新买的，前几次都做得出来过（用的不是同一次提的蛋白），我是用的1：10000的稀释倍数（说明书上推荐的），用5ml稀释0.5ul beta-action一抗，就在混匀器上混了大约半分钟，我也在想是不是beta-action没有混匀充分，因为混在一起的时间我个人觉得有点短，--所以今天洗膜后重新附了beta-action一抗--，同实验室的说我蛋白没提好，我觉得不像，这次是我蛋白提的最好的一次，浓度都可以，染膜后条带很清楚，有beta-action蛋白的可能性个人觉得很大，老师，你觉得我分析的对吗？
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发表于 2013-3-9 14:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

您好！想请教一下哪能合成硫酸基团修饰的五肽，两个Y磺化，据说合成上比较复杂，不知哪个公司能做？
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发表于 2013-3-9 14:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
18K的转膜时间确实有点长
你不能分开做吗？

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样品不够多，想节省一点的，昨天结果出来了，18kD 转2小时，300mA的条带不清楚，是不是转过了呀？如图，下面不清楚有点歪斜的是18KD的蛋白条带，前辈我想下次一张膜做四种抗体100，75，57，18kD，用8%的胶，100，75KD转三小时300mA，57，18KD转1小时300mA，这个条件可以不？谢谢~
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