【讨论帖】western blot问题解答 - 经验共享

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标题:【讨论帖】western blot问题解答

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311

发表于 2013-1-28 17:01 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请问做western-blot时，目的蛋白是膜蛋白，内参也应该是膜上组成性表达的蛋白吧，应该选什么呢？谢谢啦！

======================================

如果做总蛋白的话不需要专门选择膜上的内参
用常用的三种内参就可以
膜上内参有Flotillin

bs4665[使用道具]
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312

发表于 2013-1-28 17:03 资料个人空间短消息加为好友

小中大

有时候做WB在显色的时候会出现方格样的条带，如图
不是每次都出，没有预见性的，我们做一般都是两块一起做的，做几次都只有一块膜会出格方格，电泳转膜条件都是一样的．不知道怎么引起的，各位有没有出现过这种问题啊？

NBA[使用道具]
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313

发表于 2013-1-29 10:55 资料个人空间短消息加为好友

小中大

很简单
第一：电泳缓冲液污染（是不是反复使用了？）
第二：转缓应该新配

u234[使用道具]
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314

发表于 2013-1-29 10:55 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我用的是BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色，内参用的GAPDH，最后用AlphaEaseFC分析，半定量分析的时候应该尽可能把蛋白条带圈进去（如图一）还是应该所选的范围内全部充满蛋白条带，两种方法所得结果不同，请楼主指点！

kuohao17[使用道具]
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315

发表于 2013-1-29 10:56 资料个人空间短消息加为好友

小中大

六一的电泳仪湿转，仪器说明书上说是80mA 两小时之内完成，转65kD的时候可以做出来，但是同样条件做130kD没有条带，转膜时间延长至3小时，还是没有条带，麻烦指导一下。不胜感激！
电流能否改成100mA或者更大？
时间三小时还是再长一些？

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316

发表于 2013-1-29 10:56 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你好！我这有个结果想让你帮忙看一眼。
这个图上有野生型和重组型两种的细胞蛋白，一抗分别是针对GFP的多抗和针对m2 tag的多抗（这个是鸡多抗，故背景很多杂带），二抗是抗兔或抗鸡的。我的蛋白是融合的M2-EYFP，为什么图中都是三条带呢？请教过有个老师，他分析是isoform，你怎么认为？
谢谢先

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317

发表于 2013-1-29 10:59 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我用的是BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色，内参用的GAPDH，最后用AlphaEaseFC分析，半定量分析的时候应该尽可能把蛋白条带圈进去（如图一）还是应该所选的范围内全部充满蛋白条带（如图二），两种方法所得结果不同，请楼主指点！

=====================

应该全部选中
我用的是ImageQuant TL
最好用IOD值

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318

发表于 2013-1-29 11:00 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你好！我这有个结果想让你帮忙看一眼。
这个图上有野生型和重组型两种的细胞蛋白，一抗分别是针对GFP的多抗和针对m2 tag的多抗（这个是鸡多抗，故背景很多杂带），二抗是抗兔或抗鸡的。我的蛋白是融合的M2-EYFP，为什么图中都是三条带呢？请教过有个老师，他分析是isoform，你怎么认为？
谢谢先

=================================================

这几天我刚做了GFP的抗体检测与GFP标签蛋白裂解液的检测
我认为你请教的那个老师说的有道理
GFP有时会有小片段存在
另外一抗的稀释度调整下

NBA[使用道具]
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发表于 2013-1-29 11:02 资料个人空间短消息加为好友

小中大

六一的电泳仪湿转，仪器说明书上说是80mA 两小时之内完成，转65kD的时候可以做出来，但是同样条件做130kD没有条带，转膜时间延长至3小时，还是没有条带，麻烦指导一下。不胜感激！
电流能否改成100mA或者更大？
时间三小时还是再长一些？

=======================

25mM tris
192mM glycine
20% methanol
0.1%SDS
配制完成后放置四度冰箱预冷
转膜时降温
130KD还是很好做的
300mA恒流 2h10min
祝你好运

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发表于 2013-1-29 11:04 资料个人空间短消息加为好友

小中大

TBST的PH值6.0是不是对抗体结合有影响？

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