蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【讨论帖】western blot问题解答

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 6097  320/610 |‹‹‹318319320321322323324325326327›››|
 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【讨论帖】western blot问题解答

wood533[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76132
精华 0
积分 863
帖子 1385
信誉分 100
可用分 7745
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-1
状态 离线
3191

发表于 2013-3-9 14:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
样品不够多，想节省一点的，昨天结果出来了，18kD 转2小时，300mA的条带不清楚，是不是转过了呀？如图，下面不清楚有点歪斜的是18KD的蛋白条带，前辈我想下次一张膜做四种抗体100，75，57，18kD，用8%的胶，100，75KD转三小时300mA，57，18KD转1小时300mA，这个条件可以不？谢谢~

========================================================

我做100kDa的300mA转2个小时就足够了，其它的一个小时就可以了~
顶部
wood533[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76132
精华 0
积分 863
帖子 1385
信誉分 100
可用分 7745
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-1
状态 离线
3192

发表于 2013-3-9 14:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

楼主，今天跑胶的时候浓缩还是可以的，可是一到分离胶染料就开始扩散了，为什么？会不会是丙烯酰胺的问题呢？
顶部
loli[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 71788
精华 0
积分 736
帖子 1171
信誉分 100
可用分 6650
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-8-31
状态 离线
3193

发表于 2013-3-9 14:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

楼主，你好，接着请教，如果二抗+ECL发光剂发出荧光，是否可证明二抗与ECL发光剂都没有问题
顶部
831226[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 79782
精华 0
积分 770
帖子 1240
信誉分 100
可用分 6976
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-15
状态 离线
3194

发表于 2013-3-9 14:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
不是用的回收的beta-action抗体，beta-action抗体是新买的，前几次都做得出来过（用的不是同一次提的蛋白），我是用的1：10000的稀释倍数（说明书上推荐的），用5ml稀释0.5ul beta-action一抗，就在混匀器上混了大约半分钟，我也在想是不是beta-action没有混匀充分，因为混在一起的时间我个人觉得有点短，--所以今天洗膜后重新附了beta-action一抗--，同实验室的说我蛋白没提好，我觉得不像，这次是我蛋白提的最好的一次，浓度都可以，染膜后条带很清楚，有beta-action蛋白的可能性个人觉得很大，老师，你觉得我分析的对吗？？？

=============================

样品跑过电泳，考马斯亮蓝染胶吗？
顶部
831226[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 79782
精华 0
积分 770
帖子 1240
信誉分 100
可用分 6976
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-15
状态 离线
3195

发表于 2013-3-9 14:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
样品不够多，想节省一点的，昨天结果出来了，18kD 转2小时，300mA的条带不清楚，是不是转过了呀？如图，下面不清楚有点歪斜的是18KD的蛋白条带，前辈我想下次一张膜做四种抗体100，75，57，18kD，用8%的胶，100，75KD转三小时300mA，57，18KD转1小时300mA，这个条件可以不？谢谢~

==============

不可以
用梯度胶做吧
顶部
831226[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 79782
精华 0
积分 770
帖子 1240
信誉分 100
可用分 6976
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-15
状态 离线
3196

发表于 2013-3-9 14:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
楼主，你好，接着请教，如果二抗+ECL发光剂发出荧光，是否可证明二抗与ECL发光剂都没有问题

==================================================

不能
ECL有些有自发荧光
可以把二抗做几个不同的稀释度点到NC膜，待干燥后加ECL
查找我早前的帖子，有说明
顶部
ending[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76092
精华 0
积分 771
帖子 1242
信誉分 100
可用分 6981
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-1
状态 离线
3197

发表于 2013-3-9 14:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
不是用的回收的beta-action抗体，beta-action抗体是新买的，前几次都做得出来过（用的不是同一次提的蛋白），我是用的1：10000的稀释倍数（说明书上推荐的），用5ml稀释0.5ul beta-action一抗，就在混匀器上混了大约半分钟，我也在想是不是beta-action没有混匀充分，因为混在一起的时间我个人觉得有点短，--所以今天洗膜后重新附了beta-action一抗--，同实验室的说我蛋白没提好，我觉得不像，这次是我蛋白提的最好的一次，浓度都可以，染膜后条带很清楚，有beta-action蛋白的可能性个人觉得很大，老师，你觉得我分析的对吗？？？

样品跑过电泳，考马斯亮蓝染胶吗？

染胶了的，胶上有条带
顶部
mimili_901[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 73543
精华 0
积分 564
帖子 723
信誉分 102
可用分 4458
专家分 20
阅读权限 255
注册 2011-9-24
状态 离线
3198

发表于 2013-3-9 14:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请教几个问题：
大鼠脊髓组织，有两个目的蛋白，可恨和内参分子量相差比较近（稍微大一点点）
1.分子量和内参相差不多，有什么好办法吗？
2.目的蛋白抗体为兔多抗，一抗孵化时可以一起孵吗，目的蛋白可以和内参一起孵吗？
3.一抗选择小鼠的可以吗（小鼠和大鼠有没有交叉反应？），如果选择小鼠的单抗目的蛋白和内参可以一起孵化吗？
先谢谢了吖
顶部
xue258[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 75643
精华 0
积分 746
帖子 1171
信誉分 100
可用分 6696
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-26
状态 离线
3199

发表于 2013-3-9 14:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

版主，您好！我跑了一块胶，并且转完膜，打算先孵我的目的蛋白一抗二抗，然后显影；之后再孵GD的一抗二抗，显影。我的问题是在第一次显影结束后，PVDF膜仅用1×TBST洗涤3×5min，就孵GD的一抗，可以吗？需不需要再用5%脱脂牛奶进行蛋白封闭？或者用甘氨酸进行洗涤？
麻烦版主啦！
顶部
NBA[使用道具]
五级
Rank: 5Rank: 5


UID 75229
精华 6
积分 2497
帖子 4006
信誉分 114
可用分 20946
专家分 70
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态 离线
3200

发表于 2013-3-9 15:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
不是用的回收的beta-action抗体，beta-action抗体是新买的，前几次都做得出来过（用的不是同一次提的蛋白），我是用的1：10000的稀释倍数（说明书上推荐的），用5ml稀释0.5ul beta-action一抗，就在混匀器上混了大约半分钟，我也在想是不是beta-action没有混匀充分，因为混在一起的时间我个人觉得有点短，--所以今天洗膜后重新附了beta-action一抗--，同实验室的说我蛋白没提好，我觉得不像，这次是我蛋白提的最好的一次，浓度都可以，染膜后条带很清楚，有beta-action蛋白的可能性个人觉得很大，老师，你觉得我分析的对吗？？？

样品跑过电泳，考马斯亮蓝染胶吗？

染胶了的，胶上有条带

======================

那就的考虑一下缓冲液了
顶部
 6097  320/610 |‹‹‹318319320321322323324325326327›››|