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标题:【讨论帖】western blot问题解答

duoduo[使用道具]
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发表于 2013-3-9 15:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
从组织提的蛋白TRPV1，分子量95kd，上样量40-80ug，120mv电泳，200mA 80分钟湿转，5%脱脂奶粉+TBST室温封闭2小时，Abcam一抗 1：300 1：500 1：1000 1：2000 1：3000TBST稀释（推荐1：300-1：3000）4°C孵过夜，国产二抗1：7000TBST稀释（推荐1：2000-1：5000）室温1+小时。都是TBST洗膜3*10min。
发光剂是ThermoECL 。一抗浓度几乎都是试了试，每次都是整张膜都发光，曝光黑乎乎一片，没有条带。另外一59kd的蛋白，也是Abcam抗体，效果很好
最近换了santa抗体 一抗1：100 1：200 1：300 1：500（推荐1：100-1：1000），二抗1：5000，正好相反，膜丝毫不见发光，压片后什么都没有
稍后上图，快折磨疯掉了，老板经常催，期待版主指条路！
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发表于 2013-3-9 15:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

western blot为什么要用甲醇处理NC膜
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kulee[使用道具]
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发表于 2013-3-9 15:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

版主，您好！
最近想配个一抗二抗洗脱液，想问版主讨个配方。
谢谢！
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taoshengyijiu[使用道具]
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发表于 2013-3-9 15:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
LZ你好，请问下30-50KD的蛋白的湿转条件
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发表于 2013-3-9 15:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
楼主老师好，我又来了。我的WB一直是白板，楼主曾经怀疑是ECL敏感性低，于是我换了新的ECL，结果还是白板，因为二抗是碧云天新定的，所以一开始没怀疑二抗有问题，但是我换用别人的二抗之后，竟然发现出来影了，但是背景有点高。

见图：两张是同一张膜，不同的对比度。

======================================

膜剪的有点小
国内现在很多二抗已经做的不成样子了
建议你买可靠的试剂
这张图上的二抗稀释度再调整一下，多洗下膜
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发表于 2013-3-9 15:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
western blot为什么要用甲醇处理NC膜

=====================

活化，让膜带上正电
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发表于 2013-3-9 15:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
版主，您好！
最近想配个一抗二抗洗脱液，想问版主讨个配方。
谢谢！

=======================

呵呵
这个配方是我自己研发的
不好意思，不能给你哈
如果你想用点我可以送你点
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发表于 2013-3-9 15:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
LZ你好，请问下30-50KD的蛋白的湿转条件

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300mA 恒流或者100V恒压，40min
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发表于 2013-3-9 15:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

版主你好，谢谢您一直以来耐心的解答，我又有一个小问题，聚丙烯酰胺凝胶，怎么制成干胶，看资料说用干油，玻璃纸，玻璃纸总打褶，弄不好，望赐教！
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发表于 2013-3-9 15:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
版主你好，谢谢您一直以来耐心的解答，我又有一个小问题，聚丙烯酰胺凝胶，怎么制成干胶，看资料说用干油，玻璃纸，玻璃纸总打褶，弄不好，望赐教！

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用玻璃纸我做过
其它方法没做过
用玻璃纸：把胶放在玻璃板上，均匀覆盖玻璃纸，不能有气泡，胶上可以加一些水。覆盖好后，等它自己慢慢干燥
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