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标题:【讨论帖】western blot问题解答

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发表于 2013-3-9 16:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
再来请问lz，膜可以保存多久？因为我的一个一抗出了问题，得换。我师姐说可以用保鲜膜封起来放在-20°。但是一抗得要俩个星期才能到货。这样的话，俩个星期以后还可以用么？

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封闭后在-20度保存几个月
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发表于 2013-3-9 16:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我测蛋白分子量7kD，12%分离胶，santa山羊来源一抗1:200,1:500，二抗1:2000，转膜用NC膜，内参GAPDH做出来还不错，但是目的蛋白什么都没有，一片洁白。有老师建议用梯度胶配分离胶，膜换成PVDF膜，说截留分子量会更小些。请教fangweibin119老师，您能给我比较详细的建议和protocol吗？
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发表于 2013-3-9 16:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我的意思是我做不出来的主要原因在哪儿？是不是主要是跟分子量小有关系。有什么好的方法？
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发表于 2013-3-9 16:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我测蛋白分子量7kD，12%分离胶，santa山羊来源一抗1:200,1:500，二抗1:2000，转膜用NC膜，内参GAPDH做出来还不错，但是目的蛋白什么都没有，一片洁白。有老师建议用梯度胶配分离胶，膜换成PVDF膜，说截留分子量会更小些。请教fangweibin119老师，您能给我比较详细的建议和protocol吗？谢谢 在线等待

建议换个15%或者浓度更大点的胶试试。或者梯度胶也可以，膜用的是多大的？0.2的比较好。
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发表于 2013-3-9 16:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
为什么我做的蛋白印迹实验,蛋白70kD,一抗1:250,二抗1:3000；都要重复孵育两次才能出来条带呢？？？SOS
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发表于 2013-3-9 16:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
测蛋白分子量7kD，12%分离胶，santa山羊来源一抗1:200,1:500，二抗1:2000，转膜用NC膜，内参GAPDH做出来还不错，但是目的蛋白什么都没有，一片洁白。有老师建议用梯度胶配分离胶，膜换成PVDF膜，说截留分子量会更小些。请教fangweibin119老师，您能给我比较详细的建议和protocol吗？谢谢 在线等待

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小于12K以下的蛋白我没经验，不好意思
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发表于 2013-3-9 16:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我的意思是我做不出来的主要原因在哪儿？是不是主要是跟分子量小有关系。有什么好的方法？

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试试tricine胶系统
用0.22um孔径的膜，NC或PVDF都可以
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发表于 2013-3-9 16:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
为什么我做的蛋白印迹实验,蛋白70kD,一抗1:250,二抗1:3000；都要重复孵育两次才能出来条带呢？？？SOS

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这个。。。。
一抗孵育不完全？
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发表于 2013-3-9 16:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

LZ好，我又遇到问题了。
检测一蛋白的背景很高很高，只有一次看到目的条带，别的时候，就算新跑的胶新转的膜，也是一样的结果---加了发光液之后约1min，没有荧光，但压了10分钟后打开，看到一大片的荧光。
一抗是santa的。二抗是抗兔的，protein tech group进口分装的。
每次封闭都是4°过夜，一抗俩个小时，中间PBST洗4次，每次15min，二抗一个小时，洗4次，每次15min。昨天以为是我洗膜没有洗干净，刚好也等同学一起去显影，二抗多洗了一个小时。加了发光液之后没有见到荧光，我还以为是没有问题了。放心压片。压了30min后，打开又看到一片发光的……
但是同时孵的另一种一抗，同样的二抗，同样的洗法，检验出来了，条带很清晰很漂亮。这是为什么呢？
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发表于 2013-3-9 16:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
怪异
我用ECL发光，膜上都看到HRP作用后的棕色的带子了，但是发光却发不出来，快疯掉了，不知道是什么原因，谢谢
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