蛋白质与蛋白组学

LZ好，我又遇到问题了。
检测一蛋白的背景很高很高，只有一次看到目的条带，别的时候，就算新跑的胶新转的膜，也是一样的结果---加了发光液之后约1min，没有荧光，但压了10分钟后打开，看到一大片的荧光。
一抗是santa的。二抗是抗兔的，protein tech group进口分装的。
每次封闭都是4°过夜，一抗俩个小时，中间PBST洗4次，每次15min，二抗一个小时，洗4次，每次15min。昨天以为是我洗膜没有洗干净，刚好也等同学一起去显影，二抗多洗了一个小时。加了发光液之后没有见到荧光，我还以为是没有问题了。放心压片。压了30min后，打开又看到一片发光的……
但是同时孵的另一种一抗，同样的二抗，同样的洗法，检验出来了，条带很清晰很漂亮。这是为什么呢？

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一抗的问题

怪异
我用ECL发光，膜上都看到HRP作用后的棕色的带子了，但是发光却发不出来，快疯掉了，不知道是什么原因，谢谢

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二抗浓度太高
曝不出来正常
降低二抗浓度

我最近刚开始做western-blot，遇到一问题：
接通电源，设定恒压60伏，按输出后键后机器出现嗡名声后自动停止输出。检查一下
1：正负极没接反，
2：内槽电泳液高于矮板边缘距上边缘0.5厘米(基本满了),外槽略少（基本是电泳槽三分之一 深度）
问题出在什么地方呢？请老师帮忙解决，谢谢！！！

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仪器的问题找找厂家咨询吧

楼主，我最近做磷酸化的蛋白，曝光会出现多个条带，其中有一条和目的条带离得很近，有点难区分，目的条带下有两条表达特别高的条带，重复两次都是类似的情况，这是怎么回事啊

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1、先调整一抗稀释度
2、杂带正常

楼主你好，我是新手，最近做了两次WB背景都很糟糕，不知道是什么原因，您能帮我分析一下吗，万分感谢。我的目的蛋白是150kDa，分离胶8%，电泳200V，50min，转膜没有加SDS，bio-rad 湿转，200V 1.5h，PVDF 膜。5%脱脂牛奶室温封闭1h，一抗、二抗都是室温孵育1h，检测方式是加了ECL反应后，直接在bio-rad的成像系统里曝光5~10min，拍的照片。

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一抗名称及厂家
二抗稀释度
ECL厂家