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标题:【讨论帖】western blot问题解答

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发表于 2013-1-29 11:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

如果曝光出来,泳道之间是黑色的,就是相邻泳道之间都是黑色的,什么原因呢?
是非特异性结合么,特异性不好导致?,为什么会在泳道之间曝出条带?
请指教.
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发表于 2013-1-29 11:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
TBST的PH值6.0是不是对抗体结合有影响？

==============================

抗体在中性环境下最稳定
pH5-8左右都可以
最稳定是7左右
另外稀释抗体的时候加了奶粉等
可以对抗体起一定的保护作用
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发表于 2013-1-29 11:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
如果曝光出来,泳道之间是黑色的,就是相邻泳道之间都是黑色的,什么原因呢?
是非特异性结合么,特异性不好导致?,为什么会在泳道之间曝出条带?
请指教.

=====================

相邻的条带都连在一起吗？
上样量多少ug？
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发表于 2013-1-29 11:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问，分离胶凝后会在胶和玻璃板之间有小气泡，且都在板的两侧，胶中没有气泡。碰到过好几回这样的，板都洗的很干净，也不是同一块板，年前做的时候还没这样呢，就最近老这样，请问到底是怎么回事,怎么才能避免啊，谢谢了
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发表于 2013-1-29 11:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我这两天做的结果背景较脏，并且有的时候没有信号。今天做封闭的时候发现前两次的封闭液配成了10%的脱脂奶粉。我想问一下，10%的脱脂奶粉对western 有什么样的影响。
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发表于 2013-1-29 11:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问，分离胶凝后会在胶和玻璃板之间有小气泡，且都在板的两侧，胶中没有气泡。碰到过好几回这样的，板都洗的很干净，也不是同一块板，年前做的时候还没这样呢，就最近老这样，请问到底是怎么回事,怎么才能避免啊，谢谢了

===============================

APS与TEMED的加的量有什么变化？
现在温度升高了
这两者的量是随温度变化而变化的
温度高要少加一些
可能是凝胶速度快
另外插梳子的时候要注意看
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发表于 2013-1-29 11:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我这两天做的结果背景较脏，并且有的时候没有信号。今天做封闭的时候发现前两次的封闭液配成了10%的脱脂奶粉。我想问一下，10%的脱脂奶粉对western 有什么样的影响。

==========================

10%的脱脂奶粉不会有什么问题
我怀疑你重复使用一抗
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发表于 2013-1-29 11:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
您好 我是新手想请教几个问题
1、我用BCA方法测的蛋白浓度，用曲线计算后大约是10毫克每毫升，上样量是20微升，GAPDH的条带特别宽相邻的泳道，染色后都连在一起，是不是上样量太多？
2、以BCA法测得的蛋白浓度条内参是不是不准确，该怎样调平？
3、我跑的条带有的呈锯齿状，还有的在染色条带周围还有较淡的染色像扩散了一样，是怎麽回事?
谢谢回答 在线等待
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发表于 2013-1-29 11:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你好，我停了几个月没做试验，今天重新开工，结果发现跑WB时，蛋白样品跟Marker都在浓缩胶里分离了。
所有的试剂都新配的，而且配胶的试剂跟电泳缓冲液的pH也是昨天晚上才调的，应该没问题，后来想起来，去年也出现过类似情况，但是还没弄明白的时候就自己恢复了。
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发表于 2013-1-29 11:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
您好 我是新手想请教几个问题
1、我用BCA方法测的蛋白浓度，用曲线计算后大约是10毫克每毫升，上样量是20微升，GAPDH的条带特别宽相邻的泳道，染色后都连在一起，是不是上样量太多？
2、以BCA法测得的蛋白浓度条内参是不是不准确，该怎样调平？
3、我跑的条带有的呈锯齿状，还有的在染色条带周围还有较淡的染色像扩散了一样，是怎麽回事?
谢谢回答 在线等待

==========================================================================

哇
1，上样量太大了，一般蛋白的上样量为20~40ug总蛋白
上样量的大小取决于电泳槽上样孔大小与凝胶的厚度
2，BCA测定蛋白浓度的时候想要准确的话应该至少做双管测定
想让内参很匀的话可以做一次WB，把条带的IOD值读出来，通过IOD值再来调整总蛋白的上样量
3，分离胶在配制的时候没有充分混匀
没有凝充分
浓缩胶与分离胶同样没有处理好
都会出现你说的这种情况
good luck
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