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标题:【讨论帖】western blot问题解答

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发表于 2013-3-9 16:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

这个膜上下缘分别是95和72的marker,目的条带是82，谢谢斑竹
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发表于 2013-3-9 16:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我想问下 就是电泳缓冲液可以重复使用一次不？ 二抗用到1;1000会不会浓度过高 谢谢

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可以重复用，但是内槽不能重复用
二抗的稀释度每个厂家都不一样
需要通过自己的实验来确定
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发表于 2013-3-9 16:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

紧急求助版主：
我要做WB，我的目的蛋白分别是20kD，21kD，42kD 分子量，
（一）我该选择多少的分离胶和浓缩胶的浓度？
（二）GAPDH、beta-Actin、beta-tubulin 我该选择那个作为我的内参蛋白？
（三）我该选用哪种孔径的PVDF膜，是0.22的还是0.45的呢？
谢谢版主！不胜感激!
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发表于 2013-3-9 16:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
版主：你好！我是新手，想请教一下有关人血清做WB的相关问题。
1、我想测人血清中的抗体，分质量在20KD上下，用WB做的话效果怎么样？
2、如果可以的话，内参选什么比较好？
3、可不可以同时检测几种抗体？
期待回复！谢谢！
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发表于 2013-3-9 16:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
版主：你好！
我是新手，想请教一下有关人血清做WB的相关问题。
1、我想测人血清中的抗体，一个40KD上下，一个20KD上下，用WB做的话效果怎么样？
2、如果可以做的话，选什么内参比较好？
3、可不可以同时检测这两种目标抗体？
期待回复，谢谢！
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发表于 2013-3-9 16:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
紧急求助版主：
我要做WB，我的目的蛋白分别是20kD，21kD，42kD 分子量，
（一）我该选择多少的分离胶和浓缩胶的浓度？
（二）GAPDH、beta-Actin、beta-tubulin 我该选择那个作为我的内参蛋白？
（三）我该选用哪种孔径的PVDF膜，是0.22的还是0.45的呢？
谢谢版主！不胜感激!

=========================

1、12%分离胶，5%浓缩胶
2、beta-tubulin
3、0.45的就可以
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发表于 2013-3-9 16:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
版主：你好！我是新手，想请教一下有关人血清做WB的相关问题。
1、我想测人血清中的抗体，分质量在20KD上下，用WB做的话效果怎么样？
2、如果可以的话，内参选什么比较好？
3、可不可以同时检测几种抗体？
期待回复！谢谢！

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问题讲的不详细
是检测人血清中的抗体，分子量又为20K是什么意思呢？
是不是指20K的抗原？
内参可以选择GAPDH
不能同时检测，需要有先后
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发表于 2013-3-9 16:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
之前问过没有人回答，希望楼主能帮助一下啊，先谢谢了
肠道组织5-HT受体表达，选用B-actin做的内参。我是先表达5-HT受体，然后用0.2M NaOH 洗掉抗体，重新上的B-actin，条件为一抗1：1000过夜，二抗HRP1：5000，10000，20000 和40000一个小时，抗体没问题。但是仅1：5000和1：10000二抗时采集的ECL信号成团状且很弱，而其它两个稀释点无任何条带，请问这可能是什么原因啊？见图。
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 小中大
之前问过没有人回答，希望楼主能帮助一下啊，先谢谢了
肠道组织5-HT受体表达，选用B-actin做的内参。我是先表达5-HT受体，然后用0.2M NaOH 洗掉抗体，重新上的B-actin，条件为一抗1：1000过夜，二抗HRP1：5000，10000，20000 和40000一个小时，抗体没问题。但是仅1：5000和1：10000二抗时采集的ECL信号成团状且很弱，而其它两个稀释点无任何条带，请问这可能是什么原因啊？见图。

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先确保你的内参结果很好再做别的
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发表于 2013-3-9 16:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请教下斑竹，做大脑和心肌细胞的TLR4，位置分别为170KDa和95KDa。抗体说明书上说的是110KDa，大小隔这么多是否正常？我们也用了巨噬细胞做了阳性对照，结果什么条带都没有。一抗是CST的，浓度1：500（推荐浓度1：1000）。至于实验体系应该不会有问题，其他大小一样的蛋白都能出来，所以请教下是我们的样品有问题，还是抗体问题？需不需要提膜蛋白来做？ 谢谢
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