蛋白质与蛋白组学

请教下斑竹，做大脑和心肌细胞的TLR4，位置分别为170KDa和95KDa。抗体说明书上说的是110KDa，大小隔这么多是否正常？我们也用了巨噬细胞做了阳性对照，结果什么条带都没有。一抗是CST的，浓度1：500（推荐浓度1：1000）。至于实验体系应该不会有问题，其他大小一样的蛋白都能出来，所以请教下是我们的样品有问题，还是抗体问题？需不需要提膜蛋白来做？ 谢谢！

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1、做WB不需要单独提取膜蛋白来检测
2、分子量有差别是个大问题，每个厂家抗体都不同。需要大家进一步研究确定。
3、TLR4，CST抗体说明书中写的是转染后细胞的检测，没有说能否检测内源性蛋白，因此检测不到在情理之中。
4、如果你想投诉，希望也不大
5、可以换一抗试试，选择抗体时要注意看说明书写的是检测内源性还是转染后的蛋白。

老师好，想请教一个问题：
有这种说法2×Loading buffer中先不加β-巯基乙醇，在提蛋白的时候单独加；而5×Loading 中可以先就将β-巯基乙醇加入，提蛋白的时候直接加上样缓冲液就行？请问老师，这是什么原因啊？谢谢！

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2×与5×loading都可以在变性处理蛋白的时候加beta-ME
有些蛋白提取的过程中需要加beta-ME或者DTT，是蛋白提取的需要

楼主您好，我想请教一下我在wb中碰到的问题：
首先是关于蛋白的提取，大鼠肝脏组织，从-80度中拿出后置于冰盒中，然后每100毫克组织加500微升的蛋白裂解液（包括蛋白酶抑制剂，用的是fermentas的），然后在手握式电动组织细胞匀浆器匀浆至无肉眼可见组织，裂解10min以上，然后16,000g离心15分钟，取上清，保存在-80度冰箱。等做wb时，从-80度冰箱取出蛋白，置于冰盒上，10ul蛋白加入3.3ul的上样缓冲液（因为蛋白在冰盒中解冻较慢，所以我有手捏着EP管帮助解冻）。然后将其置于PCR仪中 95度，5min，取出，问题来了，等我上样的时候发现EP管理有沉淀物（提了2次蛋白都这样T。T），我用微量进样器上样的，所以不能很好的吸取EP管中的蛋白（沉淀物会堵住针孔）。因为是新手，不知道问题出在哪里，尽量写的详细，希望楼主帮忙指点迷津。
第二，条带拖尾巴。等我跑完WB，压完胶片，喜中掺忧。喜是因为有条带，对了下maker，应该是目的蛋白条带，忧是因为条带很不明朗，后面拖着长长的尾巴，做了2次都这样。以下是WB过程的大致条件：上样的时候，可以明显的看到，上的蛋白样品有沉淀物。蛋白47kd，浓缩胶80v，80min，分离胶120v，90min。350mA转膜90min，5%脱脂奶粉封闭2h，一抗用5%脱脂奶粉TBST 1：300配，4度过夜，TBST 10min每次，3次，二抗也用5%脱脂奶粉TBST1;10000配，室温孵育2h。TBST10min每次3次后 ECL 显色，曝光压片。

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1、蛋白定量了吗？
2、拖尾与沉淀有关，沉淀是因为蛋白变性过程中蛋白浓度太高

有个问题急需请问下老师您，
做western blot曝光后膜上有很多条非特异性条带，连可视maker最亮的那条带也曝出来了，我在一张膜上跑两份样品，同时转膜脱脂奶粉封闭，洗后切开膜分别孵育action,caspase3的一抗，结果曝光的两张膜在同一个泳道上有很多条带，就好像是跑胶染色后的效果一样。

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把一抗做几个不同稀释度

1、做WB不需要单独提取膜蛋白来检测
2、分子量有差别是个大问题，每个厂家抗体都不同。需要大家进一步研究确定。
3、TLR4，CST抗体说明书中写的是转染后细胞的检测，没有说能否检测内源性蛋白，因此检测不到在情理之中。
4、如果你想投诉，希望也不大
5、可以换一抗试试，选择抗体时要注意看说明书写的是检测内源性还是转染后的蛋白。

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是的，也是刚刚才注意到只能检测转染的蛋白