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标题:【讨论帖】western blot问题解答

dongdongqiang[使用道具]
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请问,如果加药使细胞发生凋亡,其抗凋亡蛋白的表达一定会减少吗?还是有可能不受影响的?

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这个不太清楚
用实验来说明吧
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ROSE李[使用道具]
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老师您好!
请教一个问题:我要跑一个68KDa的蛋白,打算用两张PVDF膜叠在一起转两张膜,条件是稳流350mA、2.5h。想问一下,这样的条件能够保证两张膜上都有我的目的蛋白和内参GD吗?
谢谢老师!
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mamamiya[使用道具]
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请教一下:
1. 在样品处理上,对cell 样品来说RIPA buffer liysis 和sonicate lysis 有什么区别嘛?
2.看了以前的帖子,发现和我处理样品不一样。我是在cell pellet 中直接加2X SDS loading buffer,然后sonicate,然后boiling 5-10m,没有离心(我看前面的帖子是离心取上清,上样),直接上样。请问我得方法行吗?
3.凝聚胶的浓度百分比有什么因素决定?
先谢了!
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请教一下:
1. 在样品处理上,对cell 样品来说RIPA buffer liysis 和sonicate lysis 有什么区别嘛?
2.看了以前的帖子,发现和我处理样品不一样。我是在cell pellet 中直接加2X SDS loading buffer,然后sonicate,然后boiling 5-10m,没有离心(我看前面的帖子是离心取上清,上样),直接上样。请问我得方法行吗?
3.凝聚胶的浓度百分比有什么因素决定?
先谢了!
期待回复

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1、我一般不做超声处理,直接用裂解液
2、如果加loading进行煮沸的话,不需要超声。但是一定要离心,不然会有拖尾
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第3个问题 :
3.凝聚胶的浓度百分比有什么因素决定?
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由目的蛋白分子量
一般选择3-5%
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ROSE李[使用道具]
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没明白你的意思

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我的意思是,通常转膜时,装置顺序依次是负极,海绵,滤纸,胶,PVDF膜,滤纸,海绵,正极。我现在想的是可不可以用两张PVDF膜重叠在一起,用一块胶转出两张膜。条件是:稳流350mA,2.5h。目的分子68KDa,和内参GD。老师,你觉得这样做可以吗?谢谢答复!
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我的意思是,通常转膜时,装置顺序依次是负极,海绵,滤纸,胶,PVDF膜,滤纸,海绵,正极。我现在想的是可不可以用两张PVDF膜重叠在一起,用一块胶转出两张膜。条件是:稳流350mA,2.5h。目的分子68KDa,和内参GD。老师,你觉得这样做可以吗?谢谢答复!

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这样不可以吧
可以用一张膜转好,通过marker在同一张膜上确定两者的分子量
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请问我看到很多文献做western blot检测细胞上清液中某个蛋白质的量,文章并没有说要把上清液浓缩。
但是我觉得上清液中蛋白质那么低,怎么做,是不是别人做了浓缩没有说而已。例如下面的文章,就是
Extracellular TNFR1 Release Requires the Calcium-dependent Formation of a Nucleobindin 2-ARTS-1 Complex
期待您的回答,因为我也打算在上清液中做western blot。
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yes4[使用道具]
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请问我看到有的文章说用western 检测细胞上清液中某个蛋白质的分泌。但是细胞培养上清液的蛋白质的含量很低,都是纳克级别的,怎么检测,但是文章也没有说要把上清液浓缩,请问那些文章真的没有浓缩上清液吗。?我也要做上清液检测western blot,
例如文章
Extracellular TNFR1 Release Requires the Calcium-dependent Formation of a Nucleobindin 2-ARTS-1 Complex*
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