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标题:【讨论帖】western blot问题解答

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我觉得12%的胶就可以...成功做出过17KD的蛋白.

不过其实论效果的话,trisine胶的效果会更好一些...

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17kd的 请问你的转膜条件是什么?

trisine胶?它的配方是什么? 我们这里都用SDS-PAGE好像
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呵呵,没有扫描仪
抗体是三年前的,一直分装放在-20保存的

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借你同学新买抗体或者买个小包装抗体来进行预实验
内参抗体试用如果需要的话可以站内信息联系我
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借你同学新买抗体或者买个小包装抗体来进行预实验
内参抗体试用如果需要的话可以站内信息联系我

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谢谢您,我借点别人的吧,您看我的整个步骤有没有什么问题,为什么整个膜发光呢
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您好,我是一个新手,第四次做western。最近一次的结果有的有目的条带有的没有,同样的样品做另一个蛋白就都有条带。我非常肯定样品中都含有这两种蛋白。

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我想问一下啊楼主是我一抗浓度不够的原因吗?那些地方需要改进
谢谢
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qhyu[使用道具]
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是不是因为我在转膜的时候同一个电泳槽中转两块膜而导致转膜效率不一致?
谢谢
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NBA[使用道具]
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谢谢您,我借点别人的吧,您看我的整个步骤有没有什么问题,为什么整个膜发光呢

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整张膜是ECL引起的
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还想请教您一个问题,关于抗体孵育
我之前是一张7乘5大小的膜加5毫升抗体稀释液在塑封袋里孵育,师兄说用500微升就可以,这样太浪费抗体,请问您对这个问题的看法:
另外膜用1抗孵育,在4度能放多久,2-3天应该没问题吧
不好意思,这么多问题,因为是纯新手
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wmp1234[使用道具]
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半干我常用电流
1.2mA/平方厘米膜面积,时间 22K的话 30min
会使膜蛋白变性,用2D的裂解液提取的蛋白及你想那个WB是没问题的

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我想问下 你是用一个体系转膜的嘛?
我用1:2:7=10X电转液:甲醇:dd水
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loli[使用道具]
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你好!我想问一下,为什么我的内参蛋白(GAPDH)只有在stripping后才能出来
我的条件:湿转:60v,60min,millipore 0.22um孔径
洗膜TBST,10min,三次
封闭(5%脱脂奶粉,TBST稀释)1小时
洗膜TBST,10min,三次

一抗封闭4度过夜(0.5%的封闭液稀释)
洗膜TBST,10min,三次
二抗1小时(0.5%的封闭液稀释)
洗膜TBST,10min,三次

显影ECL
第一次白板,用抗体洗脱液洗脱后,重新重复封闭及以后的过程,才能有内参
困惑很久,盼解答,谢谢!
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qumm1985[使用道具]
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您好,重新贴一下,我不太会贴图,不知道这次会不会成功。上面的条带是目的条带,下面的一排是目的条带样本对应的tublin。


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2013-3-13 17:20
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