小中大
老师你好：做了快两个月的WB 可一点起色都没有。我的指标是IRE1 ,P-JNK，内参均为gapdh.说说我的步骤：8%分离胶，5%浓缩胶。上样是50ug，15ul,70V,120V,转膜液是10%，且加了0.37gSDS。两指标均用此转膜液，P-JNK及GAPDH转45分钟后，暂停伯乐电泳仪，将其取出，再继续转膜45分钟后取出IRE1的膜，结果两者的maker均看不见。立春红染膜后，有时候有条带，有时候无。5%牛奶封闭2小时室温，TBST洗10*3min,santa的IRE1一抗1:500稀释，santa的gapdh1:500稀释，cell signaling的p-jnk 1:2000稀释（均采用碧云天的一抗稀释液，以便抗体再利用），4度摇床过夜，次日约孵育20小时候，TBST洗10*3min,二抗1:5000（建议是1:5000-1:100000）室温1h,TBST洗10*3min,ECL发光曝光，机器曝光。结果：IRE1有么是白板，要么是黑的只有整个条形膜形状，内参有时候有，但条带不全，P-JNK开始几次还可以，后来也组的不好了。我的问题：1，此两指标是否要用不同的分离胶？大分子8%，小分子10%？
2，转膜液是否各自一份，大分子应该加SDS且甲醇浓度10%？小分子不加SDS，甲醇20%？
3，我的转膜时间是否可以？但结果总是不稳定，大多数是maker不清楚。
4,像我这种情况应该采取哪种条件的转变？
谢谢！
