小中大我将X基因分别构建在Invitrogen的pcDNA3.1，还有一个是带Myc标签的，两个载体。
蛋白30kd（分泌蛋白），买的伯乐的胶，配12%的，跑得很开了。伯乐的膜，孔径0.2um转膜350mA，90min(也试过40V，8h，差不
多)。转膜液配方：14.4g Glycine，3g Tris，200ml甲醇。室温用5%脱脂牛奶PBST封闭1h。
一抗(特异抗体购自R&D的和Myc标签抗体购自Invitrogen)6h，洗4*10min；二抗(Santa)3h，洗4*10min。
现在的问题是：
1. 需要很大的上样量（>100ug，用伯乐的染液Bradford测的），少了带出不来
2. 只有表达量很高（瞬转蛋白）的时候才能出带（但效果很好，带很清晰）
3. 试过一抗孵育室温2h，带出不来
4. 都说带标签的western会比较好做，但我做的效果甚至不如特异抗体
5. 好像大家做β-actin的时候一抗室温一个小时，压片的时候5秒钟之内就有很强的带，而我的一般需约1min
怀疑过HRP显色底物，但和别人的比较过，虽然我们的出来没背景带稍弱，但用他们的试了下，有背景也没带。
请问楼主：问题在哪里？该如何改进，才能提高体系的灵敏度啊？
