蛋白质与蛋白组学

原来请教过您条带呈锯齿状的原因，我发现在提蛋白时，离心后上清的上面还有絮状物，如果不把他吸上去，就不会有锯齿状条带了！ 另外 还想请教您：western检测到了蛋白，为什么免疫组化就检测不出来呢？

==========================

一般做WB的抗体都可以做IHC
但是能做IHC的不一定能做WB

不好意思，刚看到您的建议是20-40Ug蛋白上样量，这样子的话我那0.07ug/ul的浓度肯定是不行了，请问有什么好的建议没有啊？我是用25平方厘米的培养瓶养的细胞，怎么样蛋白浓度能高一些呢？谢谢！在线等 ～～

===========================

减少裂解液的量
延长裂解液时在冰上的孵育时间

怎样判定蛋白降解了？
从结果看，如果位置比目的蛋白低，并有多条产物带，是不是降解了？
如果位置比目的蛋白位置高，甚至高出好多，也许成倍，那又是什么情况？蛋白耦合？二聚体？蛋白质修饰？
如果内参正常表达，又能说明什么？

=======================================================================================================

1，以前你做过的蛋白有很强的条带，但是现在没有了
2，有时候有很多条带并不一定是降解的，有可能是抗体制备时选择的多肽序列具有同源性，以致你做WB时会有很多非特异性条带
3，有可能是二聚体，比如BSA就有这样的情况，而且蛋白修饰比如糖基化也会使位置发生变化
4，内参的表达量很大，表达正常只能说明你做WB时的体系没有出现问题

求助！
请教：我现在做98KD 和90KD 的两个胞膜蛋白，上样量60-80ug，电转40v240min，5%奶粉+0.1%TBST 室温封闭一小时，一抗1:200(Santa Cruz),4度过夜和室温1小时都试过，洗膜0.1%TBST12min*3次，二抗1：2000，室温1小时，洗膜0.1%TBST10min*3次，ECL发光。曝光5秒到两天，条带特别淡，背景倒是很浅。
请教问题出在哪里？做何改进？
感激不尽！

======================================================================

上样量够了，整个操作没有什么问题
而且曝光时间我认为超过30min就没有太大的意义了
我建议你改变ECL的敏感性
你可以试试康为世纪的ECL超敏产品，有试用装（但是超敏的ECL需要加大二抗的稀释度）
good luck

非常感谢版主及时的帮助！我遇到和四眼看科学 有点类似的情况。前几天W出了110kd目的蛋白的，后来重复第3次的时候就有了70kd的杂带，再后来只剩下了70kd蛋白带了。重复的时候我是重新从-70取出的样本。用丽春红染色后110kd是有蛋白条带的。其余条件都是一样的。我想知道如何确定是抗体的原因还是其他？

===============================================================================

严格来说立春红染膜110k左右肯定是有条带的
抗体的稀释度你是不是改变了（比如直接稀释了，或者用了第一次又用第二次，都会降低抗体的稀释度）
抗体质量的好坏也有影响
另外在蛋白提取的时候一定要注意加蛋白酶抑制剂以及操作的时候在冰上进行