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标题:【讨论帖】western blot问题解答

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发表于 2013-3-15 10:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
一抗稀释度多少？可以改变一下试试
另外一抗是否孵育过夜？

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一抗1:2000和1:1000都试过，孵育时间很长，室温6小时，也试过4度过夜。再试试1:500的看
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发表于 2013-3-15 10:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
您好，我是新手，请教一些问题！

1，我现在正做目标蛋白，显影时加发光剂能发亮，但是将胶片放入显影夜时胶片就变成了黑色，看不到条带。但是暗夹里的目标蛋白一直在亮，没有淬灭。现了好几次胶片都是黑板，这是怎么回事呢？

2，做内参时，也是在显影液中随着条带的出现胶片就逐渐变黑，将胶片放入定影液也没什么作用，作出的背景特别黑。只有几个胶片背景不黑，这是怎么回事。也红外线有关系吗，还是胶片或显影液的问题。但是以前师兄师姐做事条件相同也没有这样的情况？

3，定影液的作用是什么，能让背景变淡吗，怎么每次把胶片放入时条带都会变粗呢？

谢谢啊！！

=========================

胶片过期或者已经全被曝光了
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发表于 2013-3-15 10:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
一抗1:2000和1:1000都试过，孵育时间很长，室温6小时，也试过4度过夜。再试试1:500的看

======================

室温不能孵育这么长时间

长时间孵育要在4度
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发表于 2013-3-15 10:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
室温封闭两小时，一二抗1比1000的稀释，一抗过夜，二抗两小时，

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不懂为什么会是这样的图？

同一张膜，为什么有两条带？第二张杂带比较浅了，但都是可以看的到的。还有第二张为什么成黑色的了，是因为在显影液里的时间长了吗？感觉从显影液里拿出来后就是黑色的了。


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发表于 2013-3-15 10:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
室温封闭两小时，一二抗1比1000的稀释，一抗过夜，二抗两小时，

不懂为什么会是这样的图？

同一张膜，为什么有两条带？第二张杂带比较浅了，但都是可以看的到的。还有第二张为什么成黑色的了，是因为在显影液里的时间长了吗？感觉从显影液里拿出来后就是黑色的了。

===================================

1、胶片可能曝光了

2、调整一抗稀释度，用1:2000,1:4000试试
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发表于 2013-3-15 10:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

细胞总蛋白抽提后，用BCA法测得总蛋白浓度只有0.18 ug/ul,后续WB还能能不能做啊，有什么方法可以浓缩吗？
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发表于 2013-3-15 10:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

曝光怎么会是黑色的呢？我的是有大部分黑色的了
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发表于 2013-3-15 10:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
您好，老师我想请假一些问题。

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最近我做出的条带都连在一块，一开始上样量是20微克，我感觉可能太大了，逐渐减做过一次12微克的还是连在一块，最近我就将上样量减到10微克，条带很细还是连在一块。我用的是10%的分离胶和5%的浓缩胶。如果是胶的问题我应怎么改变呢，配方是什么样的啊，谢谢啊
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发表于 2013-3-15 10:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请高手指点啊！！
老师好，我最近做内参胶片上的条带总是连在一块，一开始以为是上样量过大，我现在上样量为10微克，出来的条带很细，但还是连在一块。是不是胶出了问题啊。我现在用的是10%的分离胶和5%的浓缩胶。如果是胶的问题应怎么改变啊，麻烦说些配方啊？谢谢啊！！

我是自己配的胶。10%分离胶：（双板）蒸馏水4.0 ml，30%AcrBic3.3 ml，1.5mol/l Tris.Hcl(PH8.8) 2.5 ml, 10%SDS 0.1 ml, 10%APS 0.1 ml, TEMED 4 ul。。 5%浓缩胶：（双板）蒸馏水2.8 ml, 30%AcrBic 0.66 ml, 1.0 mol/l Tris.Hcl （PH6.8) 0.50 ml , 10%SDS 0.04 ml, 10%APS 0.04 ml, TEMED 4 ul。
谢谢啊！
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发表于 2013-3-15 10:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
细胞总蛋白抽提后，用BCA法测得总蛋白浓度只有0.18 ug/ul,后续WB还能能不能做啊，有什么方法可以浓缩吗？

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没试过浓缩的方法

这个浓度有点低，能检测到部分蛋白
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