蛋白质与蛋白组学

最近做大鼠脑组织的NOS，分子量130KD左右，用的是12%分离胶，4%浓缩胶，80V跑到头。转膜是20%甲醛，200mA恒流湿转40分钟.5%脱脂奶粉封闭2H，然后孵育1，2抗。跑完膜marker很清楚，但是曝光看不到目标蛋白，而且背景比较亮，请问可能是什么原因？是我的操作条件有什么问题吗，我看前面楼主的回答说是要300mA，2H，是不是这样更好一点？另外分离胶和浓缩胶的浓度还需要调整吗？

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分离胶:8%

一抗、二抗需要做稀释度

请问Trans-SD 通用型半干转印电泳槽转膜一个3×1厘米的膜，蛋白是内参，36的。

一般要多久的时间？多少的电流？

我用的是0.01A，三个小时时膜上有marker，胶上也有。

转膜的最佳效果就是胶上刚好转没，而膜上很清吗？

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3×1厘米的膜，用的是0.01A，三个小时

这么长的转膜时间还有marker啊？

正常情况下这个条件蛋白都转过了

用什么缓冲液？

你好楼主，我想问一下就是我做jnk。做了好几次都出不来条带只有背景色，把上样量从原先的40ug调到了80ug还是那样，我做的这个蛋白是两条带的，分子量好像为46，,54

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恩

这些蛋白我常做

调整一抗、二抗浓度

请问半干转恒流前面有1.2毫安/平方厘米，如果有两张膜同时转的话，是两张膜的面积相加呢还是按最大的算？：

内参36KD,目的蛋白106KD,请问这两个每个要转多久呢按上面的电流量？：

没有染色直接曝光，请问转膜的最佳效果就是胶上没有而膜上很清楚吗：？

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1、电流相加

2、按照目的分子量来转

3、最佳效果不好说，在膜上比较清楚的丽春红染色条带就行

老师的帮助，现在终于把内参做出来了，接下来要做目的了，我要做的是P糖蛋白，今天我才发现原来以前我因为这个抗体的问题曾经在站内短信中咨询过您，现在还是有几个问题请教

1，P糖蛋白是一种跨膜蛋白，那提蛋白的时候是按常规方法还是特殊的呢，我用的是买的蛋白裂解液RIPA，说明书上说可以用来提膜蛋白，但是实验室老师建议收集细胞冰浴超声裂解，究竟应该怎样呢

2，我买的一抗是abcam的鼠单抗说明书上western稀释浓度1/20,是1:20的意思吗，那也太费抗体了吧

3，我内参的片子，前两个是同一样品，后两个是同一样品，为什么最后的条带比前面的弱呢

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呵呵

这个蛋白我自己做过几次，也指导过一个站友做过

操作有点麻烦

您好！请问Western blot显影后的带连在了一起是什么原因造成的？有什么解决方法？谢谢

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胶本身问题

样品有沉淀造成泳道间的扩散。。。

上样量大等

都有可能造成

可以把图片挂上来看看

请问Trans-SD 通用型半干转印电泳槽转膜一个3×1厘米的膜，蛋白是内参，36的。

一般要多久的时间？多少的电流？

我用的是0.01A，三个小时时膜上有marker，胶上也有。

转膜的最佳效果就是胶上刚好转没，而膜上很清吗？

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3×1厘米的膜，用的是0.01A，三个小时

这么长的转膜时间还有marker啊？

正常情况下这个条件蛋白都转过了

用什么缓冲液？

我用的是20的甲醛呀。膜一般要在纯的甲醛里浸多久呀？浸的太久会不会影响转膜呀/

3×1厘米的膜，用的是0.01A，三个小时

这么长的转膜时间还有marker啊？

正常情况下这个条件蛋白都转过了

用什么缓冲液？

我用的是20的甲醛呀。膜一般要在纯的甲醛里浸多久呀？浸的太久会不会影响转膜呀/

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转膜一般用甲醇