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标题:【讨论帖】western blot问题解答

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发表于 2013-3-15 10:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问老师，目的蛋白100K左右，10%的分离胶，5%的浓缩胶,电泳2h, 5.0*8.3cm的PVDF膜(0.4um孔径)，两张，半干转，15V，30min，这个条件可以吗？最最困惑我的是分离胶的浓度，和半干转的条件，希望老师帮忙解答，谢谢~~
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发表于 2013-3-15 10:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

错啦，0.2um孔径，不好意思哈~~
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发表于 2013-3-15 10:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
0.22um的PVDF膜比0.45um的容易有背景。想请教下老师，依据什么来选择PVDF膜的孔径呢？目的蛋白的分子量吗？如果是，那么是怎么划分的呢？谢谢
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发表于 2013-3-15 10:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问如果用odessay的仪器拍western，即红外荧光法，是否可以来源不同的一抗，同时孵育？例如磷酸化与非磷酸化的两个一抗的抗原，甚至大小相同的，结合会有影响么？
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发表于 2013-3-15 10:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问做磷酸化蛋白是不是要添加磷酸酶抑制剂？平时用的是罗氏的cocktail，貌似只包含蛋白酶抑制剂
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发表于 2013-3-15 10:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请教楼主，我做il-1β的western blot，从组织中提取蛋白质（用的是碧云天的中等强度的试剂盒）。转膜用45分钟，一抗用5%脱脂牛奶封闭。一抗是santa的用到了1:100，上样量用到了100微克。但还是没有出……
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发表于 2013-3-15 10:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

相关疾病：
禽流感
我用烟草瞬时表达系统，表达了一种与禽流感病毒有关的蛋白，RNA水平已经检测到，但是做western blot，一直没有结果，请问是什么原因，另外我还想知道怎样才能提到活性蛋白，向各位前辈请教
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发表于 2013-3-15 11:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问老师，目的蛋白100K左右，10%的分离胶，5%的浓缩胶,电泳2h, 5.0*8.3cm的PVDF膜(0.4um孔径)，两张，半干转，15V，30min，这个条件可以吗？最最困惑我的是分离胶的浓度，和半干转的条件，希望老师帮忙解答，谢谢~~

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转膜条件恒压的我不太了解

我常用恒流

1.2mA/平方厘米膜面积，1h30min
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发表于 2013-3-15 11:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
前面听到fangweibin119老师说：0.22um的PVDF膜比0.45um的容易有背景。想请教下老师，依据什么来选择PVDF膜的孔径呢？目的蛋白的分子量吗？如果是，那么是怎么划分的呢？谢谢

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蛋白分子量
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 小中大
请问如果用odessay的仪器拍western，即红外荧光法，是否可以来源不同的一抗，同时孵育？例如磷酸化与非磷酸化的两个一抗的抗原，甚至大小相同的，结合会有影响么？

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同时孵育的前提是看一抗的来源，小鼠单抗可以这么做

分子量大小相同的没法一起做
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