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标题:【讨论帖】western blot问题解答

lgm[使用道具]
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发表于 2013-3-15 11:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

那磷酸化与非磷酸化的抗原，大小一般相同的，都要先敷磷酸化然后strip才可以敷另一个么
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发表于 2013-3-15 11:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
老师您好，最近western blot要做个内参，用tubulin，目的蛋白为23kd，目的蛋白一抗是鼠源，二抗是羊抗鼠。tubulin

一抗是兔源，二抗是羊抗兔。请问两种一抗可以一起孵育吗，两种二抗可以一起孵育吗？也就是说不用剪膜。

tubulin分子量是55kd的，12%的分离胶，目的蛋白和tubulin应该分得开。

==========

不太好吧
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发表于 2013-3-15 11:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
那磷酸化与非磷酸化的抗原，大小一般相同的，都要先敷磷酸化然后strip才可以敷另一个么

=====================

可以

也可以分两次电泳再做
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发表于 2013-3-15 11:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你好，最近做磷酸化的NF-KbP65，显出来的带不清楚，但还可以，而且就是maker那一边总是特别黑，导致空白都看不到，怎么回事？谢谢楼主的回答啊。
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eric930[使用道具]
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发表于 2013-3-15 11:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
不太好吧

========================================

也就是说最好将膜剪开，分别孵育一抗，二抗吗？
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orangecake[使用道具]
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发表于 2013-3-15 11:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我们构建了一个定位载体，就是将基因和GFP融合，然后用烟草瞬时表达系统表达，后来用共聚焦显微镜观察，初步认为是胞间蛋白。另外，我们还构建了表达载体，带有6个HIS标签，western blot 时，我用一抗是HIS 抗体，二抗是辣根过氧化酶。western blot 的体系应该没有问题
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mimili_901[使用道具]
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发表于 2013-3-15 11:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
ECL后暗室荧光条带很清楚，但曝光5分钟才能有很弱 的出来，再加发光剂就怎么也曝光不出来了。

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把膜用TBST或者PBST洗后

再加ECL

ECL淬灭快的话：注意封闭液是否时间过长、抗体是否回收使用、膜是否碰到金属物质


ecl前有TBST洗的，封闭用了5%牛奶一小时，抗体是新配的，膜每次都是夹子从封闭袋里来来回回的，算金属吗？

另外同样的条件，就是一抗有回收，今天什么荧光都没有了，以前也出现过这情况。郁闷啊。
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98776langtao[使用道具]
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发表于 2013-3-15 11:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请教老师：

现在在验证Y2H的诱饵蛋白在酵母中是否能够融合表达。做了两次，都只有空载的带（所以裂蛋白方法应该没有问题）。第一次上样15ul，曝了5分钟，只有空载的条带。第二次加大上样量，1.5的胶板上样40ul，曝光了8分钟，在72kd处隐约有很细的带，但空载泳道在此地方也有条断断续续隐约的条带，所以怀疑是非特异的，不是我的目的条带。

WB的条件是转膜100V 65min，5%脱脂奶粉封闭，一抗（myc-tag）1：1000，二抗1：10000。

下次准备提高下一抗稀释比例，再做看看。您觉得是WB的问题还是此基因在酵母中表达就不是很好，已经裂过三次蛋白了，每次表达量都不是很好。

谢谢`
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nn255[使用道具]
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发表于 2013-3-15 11:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
老师 您好

我的蛋白分子量是130KD，我要是用350mA湿转，要转多长时间呢
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NBA[使用道具]
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发表于 2013-3-15 11:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你好，最近做磷酸化的NF-KbP65，显出来的带不清楚，但还可以，而且就是maker那一边总是特别黑，导致空白都看不到，怎么回事？谢谢楼主的回答啊。

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1、marker的蛋白中，有磷酸化的NF-KbP65能识别的表位

2、下次做的时候把marker与样品间空一泳道，用1×loading
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