蛋白质与蛋白组学

老师，请您帮忙看一下这个图是怎么回事儿
附件里的两张图一个是beta-actin,一个是我的目的蛋白。上样量是80ug。问题有二：1、不知道为什么beta-actin各上样孔之间会连在一起？而同在一块胶上跑出来的目的蛋白就是分开的。我用的是恒压60V跑5%的积层胶，用90V跑12%的分离胶。也注意了在37度约30min促凝后，让胶在室温冷却约40min。我是用的在鼎国昌盛买的5*的SDS上样缓冲液，是把他终体积到1*用的。2、我是同时跑的两块完全一样的胶，两个的加样量完全一致，样品也是相同的，可我的目的蛋白两个做出来结果却不太一致，这是为什么呢？尤其是第一个问题，请老师帮忙指点一下。我也问过师姐，她们也不知道原因。

开始的时候，我的内参老是出不来，考虑之前可能是因为我ECL发光剂用的量不够。现在是出来了，背景却比较高。我们实验室用的是3%的BSA封闭，我可以用1%BSA来配β-actin的封闭液不？

===================================================

1、上样量大，因为目的与内参的含量不同

2、结果不一致的原因很多，转膜、抗体、ECL孵育等都会存在

最近想做western，但不知道买那个公司的试剂，望做western的高手们给我支支招，先行谢过

==================================

这个有点笼统

是买但各组分试剂

还是买直接配制好可以用的成品试剂？

是的，他们公司的东西有这么不好吗

=================

不好的几率挺大的

您好！请问若蛋白的分子量小于20转膜需要多长时间？谢谢

==========================================

300mA恒流，湿转，20min左右

1.2mA/平方厘米膜面积，恒流，半干，15min左右

最近在做Thy1的western blot，分子量是18kDa，跑出来的条带特别不清楚，当时转完膜后最下面的marker的两个条带都看不清，洗完后更是什么都没有了，搜索了一下说是转膜要用小孔径的，我用的是0.45um的，还有的说膜要固定一下，请各位战友指点一下啊

=================

用0.22um孔径的膜

请教老师，我用10%的分离胶，5%的浓缩胶，预染marker10K~170K的，电泳完之后95k以上的条带分的不是很开(明显比说明书上的紧凑得多)，而我的目的条带在95k~130K之间，不知道这样会不会有影响？还有有什么办法能让marker上95k~130K之间的条带拉宽些吗？我的电泳条件是80V，2h. 谢谢

==============================================================================

影响不会很大

电泳:90V，20min左右，溴酚蓝进入分离胶，调电压至150V，看marker泳动位置，合适后停止电泳

请问版主，封闭液，一抗和二抗分别可以用多少次？回收后能保存多久？

============================================

1、BSA封闭液，我一般使用3-4次，回收再4度保存

2、一抗回收，-20度保存，很少再次使用

3、二抗，从不回收

老师您好

压片时，把NC膜放到两层塑料膜间，合上塑料膜时原本一些发光的条带就不亮了，有时是过一会儿全都灭了，这是怎么回事？我上样量40ug，一抗1：500（之前试过上样30ug，一抗1：1000，不出现条带）二抗1：5000

==============================

把胶片直接接触到家了ECL的膜了？