蛋白质与蛋白组学

请教楼主，我的目的分子量为AQP8-27KD，用的是0.45um的PVDF膜（还是要选择0.22um的膜），浓缩胶4%，分离胶10%，转膜300mA，45分钟（丽春红染膜，未见任何蛋白条带，最后曝光也出来了另一目的p44/42），牛奶封闭2小时，TBS-T洗膜三次，每次15分钟，一抗用的是ABcam 推荐浓度为1:200-500，预实验用过1:300和1:400两个浓度，一抗孵育4°过夜，后洗膜三次，时间同上，二抗用1:2500，碧云天的，洗膜三次，最后ECL发光，目的未见条带，我的内参和另一目的都有比较条带。刚开始用的是satancruz的一抗AQP8，它的分子量是34KD,没做出来，现在换了个ABcam的抗体，还是做不出来。很是郁闷。高手帮忙解决一下。

我还想问下，

1、同一目的，不同公司的抗体，分子量也不同的吗？

2、丽春红染膜，为什么没条带，但最后出现条带？

3、我的转膜条件如何改变一下？

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1、用哪里的蛋白抽提试剂？

2、两种孔径膜都可以用

3、分离胶用12%的

4、分子量问题由不同公司自己决定，不要在分子量上纠结，出来结果大致相同就行

5、转膜条件，300mA 恒流， 30min

提取组织蛋白做western-blot，对于标本的采集有些什么要求，比如说时间？

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具体的你可以看我个人资料中的qq号，可以详细聊

标本采集后用-80或者液氮保存

采集的组织需要把血液用预冷PBS或者生理盐水清洗干净，之后冻存就行

老师你好，本人初学，现在用肺癌细胞系做一个较新的蛋白，目标蛋白在59kda，内参actin。上样量40ug和80ug都试过，分离胶浓度10%，80v浓缩胶，120v分离胶。用0.45um的pvdf膜，转印湿转200mA，90分钟，mark转的不错。奶粉封闭2h，抗缓1%BSA，一抗浓度abcam1:250（推荐1：1000~1:200）或scbt1：200（推荐1：1000~1:100），四度过夜。中杉金桥二抗1:5000，2h。每次洗膜均为tbst15min*2+tbs15min。发光液是普利莱，压30min，目标蛋白发的很不理想，浅的几乎没有的黑影，完全无法确定是不是条带，内参发的不错。请老师给点建议，不甚感激！

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蛋白如何提取的/

转膜后用丽春红染色没？

先检测转膜效果

再检测后续的一抗、二抗检测效果

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今天用半干转13V，50min做了一下，tubulin内参出来了，不过没有想象中的强，听师兄师姐说细胞中含量很高，不过在显色时肉眼勉强能看到，比我目的蛋白的亮度小很多。最后曝的底片上还有非特异性条带。造成这种情况回事因为tubulin一抗浓度偏小，二抗浓度偏大吗？