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标题:【讨论帖】western blot问题解答

windy+++[使用道具]
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您好!想请教您一个问题,我做的是小鼠组织的蛋白,目的蛋白预测是43KD,5%牛奶封闭液室温封闭5h,一抗是自制的多抗,4度过夜。最后显色,杂带太多,而我使用的marker没有43这条,只有36 、55,无法分辨那条是我要的。请问有什么方法可以改善一下杂带多的问题?谢谢!

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先调整一抗的稀释度,多试几个

封闭不需要这么长时间把
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windy+++[使用道具]
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我要做的是11kDa 的小分子蛋白,蛋白Marker最小是10kDa,20%浓度跑胶,半干法转膜20V恒压,转30min,但是总也做不出条带,请问是怎么回事啊?谢谢~

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20%分离胶跑胶?

不是吧

配胶的丙烯酰胺储液浓度是多少的?
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请问是不是组织的蛋白杂质太多呢,我把我取的蛋白上清又反复离心了几次,结果每次离心都能有沉淀析出来,请问还需要再离心吗?

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组织容易有脂肪

如果上清最上层有浮着的脂类

需要吸取上清后,再次离心

且提取的组织蛋白不能再-20度冻存,融化后会有沉淀
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我是新手 ,没有做过western,这两天在看做western的资料,我买的是GENSCRIPT ONE HOUR WESTERN KIT。但是我不知道做western前,对提蛋白的要求是什么?就是怎么准备用于做western的蛋白。我有两种蛋白,一个是胞质蛋白,一个是胞膜蛋白。提蛋白是不是用试剂盒?然后提取的蛋白还要怎么样处理才能用来做western呢?什么是调等浓度啊?蛋白质测了OD值,怎么根据OD值算呢?由于没有做过,所以很多不知道。对园子里的好多帖子也看不懂。好多试剂也不知道是干什么用的。谢谢楼主指点一下。
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vivian4123[使用道具]
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组织容易有脂肪

如果上清最上层有浮着的脂类

需要吸取上清后,再次离心

且提取的组织蛋白不能再-20度冻存,融化后会有沉淀

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谢谢,但是请问如果我放4度保存,对蛋白的本身会不会有影响,如果我放-20冻存的话,每次上样前都离心一次可以吗?谢谢!
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wmp1234[使用道具]
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你好,

我的WB做出来之后,目的蛋白的大小不太准。本来是26kD的蛋白,但却在34kd(Marker)以上的部分有比较重的带子,在26kD处有非常模糊的带子,几乎看不到但在曝光时间长的时候能看出痕量的带子。不知哪条是我的目的带子?

另外还有一事不明白,就是同样的一分子,不同公司的抗体却显示的大小不一样是什么原因?按理说蛋白大小在跑胶时确定的,跟抗体有什么关系呢???
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想知道内参选择的依据是什么?

GAPDH 和ACTIN的区别?
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谢谢,但是请问如果我放4度保存,对蛋白的本身会不会有影响,如果我放-20冻存的话,每次上样前都离心一次可以吗?谢谢!

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样品放四度保存?没搞错吧
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NBA[使用道具]
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想知道内参选择的依据是什么?

GAPDH 和ACTIN的区别?

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目前好像没有特别的依据

错开与目的蛋白的分子量

在有些处理条件下内参容易有变化,这时候需要选择内参

做肌肉组织的话,actin就不好
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ququer787[使用道具]
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最近烦扰我很长时间的一个问题,想请教一下LZ老师。

这段时间actin一直做的很差,而目的蛋白却还可以,不知是何原因!每次actin显出的条带都像一条弥散的棍状带(也不直),不能辨认明显的泳道,且条带弥散模糊,有点乱哄哄的不成样子,根本无法用。但目的条带较好,泳道清楚,条带较直。

1.很早之前用同样的条件做出来的actin条带很好,actin用完后重新购买了同货号的actin,条件没变再做便出现这种情况;

2.已更换过别人的actin(别人做的均较好),仍然没有改善,看来不是抗体的问题;

3.一抗浓度由原来的1:1000更换为1:2000,也未见明显改善。

不知是胶(也是用的以前的配方)有问题还是电泳的问题,为何单单actin不好,目的蛋白没事?十分苦恼,恳请LZ老师帮忙分析一下原因,提出解决办法,谢谢
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