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标题:【讨论帖】western blot问题解答

98776langtao[使用道具]
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发表于 2013-3-15 16:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
本人正在做AQP4（29KD），12%的胶，一抗1:1000（一抗为多克隆抗体），二抗1:10000，封闭2小时，结果是多克隆杂带太多，与目的条带分不清，现在很着急啊，请大家指教
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鸽子不哭[使用道具]
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发表于 2013-3-15 16:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
本人正在做AQP4（29KD），12%的胶，一抗1:1000（一抗为多克隆抗体），二抗1:10000，封闭2小时，结果是多克隆杂带太多，与目的条带分不清，现在很着急啊，请大家指教

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我也和你有同样的问题，目的蛋白的一抗也是多抗 (抗血清),条带很杂，目前还在调整条件中~同求指教
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owanaka[使用道具]
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发表于 2013-3-15 16:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我现在做的是一个16分子量的蛋白，转膜后立春红染膜条带10-90都很清晰，但是没有曝出条带，一抗是cst的，之前也有一次是这样，结果我又重新利用膜再孵了一次结果曝出了不很清晰的条带，不知是一抗问题还是别的原因。
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发表于 2013-3-15 16:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请教前辈：我做的蛋白分子量25kD，用5%压缩胶，80V，45min，12%分离胶，120V，2h，LB在压缩胶底部是压成一条直线的，但是进入分离胶后就有点分开越下去就越开，有时会出现三条相连的线，显影时发现蛋白会有重影。查了配胶用的tris-hcl，PH是没有问题的。还有相同东西，相同条件配10%的胶跑就没有问题。还请帮忙解疑！谢谢！！
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wmp1234[使用道具]
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发表于 2013-3-15 16:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你好，有个问题请教。做PARP，如果用核蛋白提取试剂盒提蛋白，需要超声处理吗？

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用哪个公司的试剂盒呢？

问：还没拿到试剂盒，准备用的是Pierce的NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents（cuturl('http://www.piercenet.com/products/browse.cfm?fldID=06010435')）。还有请教一下，做Cytochrome C，由于其定位于线粒体，提蛋白是否需要特殊处理？我看有的文献就是用总蛋白做的。能检测到吗？正打算做。

）
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yjf1026[使用道具]
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发表于 2013-3-15 16:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

老师您好，我想请问一下：我跑的蛋白分子量是183。最近跑了几次泳道都很脏，蛋白条带也不是很清楚，反而在250左右条带特别清晰。请问泳道怎么处理？目的条带不清晰主要是什么原因引起的？（上样量为60ug)

谢谢老师，在线等待，O(∩_∩)O~
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发表于 2013-3-15 16:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

老师您好：

请教一个问题：我最近在做iNOS的western blot。但做了两个多星期了 还是没有结果，我用RIPA裂解液（碧云天）提的蛋白，abcam的一抗（鼠单克隆）,二抗是碧云天羊抗鼠二抗。显影后，背景较深，，但是不见目的条带，请问是何原因？谢谢！
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发表于 2013-3-15 16:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
斑竹 您好！

我最近做western，样品为组织总蛋白，一抗是用自己的重组蛋白免疫兔子制得的，没测滴度，按1：100稀释使用，二抗为国产，1:5000。湿转，60伏2小时，0.45的PVDF膜。之前曾做成功过，但是最近做的时候总是这样：把PVDF膜放到ECL发光液上，一片荧光，而且也看不到条带，爆出的胶片一片黑，没有条带状的，请教如何改进？

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建议一抗做一下预实验
兔血清的话1：100稀释度太低了
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发表于 2013-3-15 16:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
楼主你好，想请教一个问题，今天WB显影结果出现和考马斯亮蓝染胶很像的结果，每条蛋白都现出来了，很多很多条带，但是有没有目的条带楼主觉得可能是什么原因呢？

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偶尔出现这样的情况？
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发表于 2013-3-15 16:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
不好意思我没标注，上面那条是tubulin 左下是actin 因为我目的比较杂（一抗是抗血清）所以用它来指示位置，右下就是我的目的了，恳请楼主帮忙分析下

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咋不用抗体？

抗血清容易有杂带呢
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