蛋白质与蛋白组学

老师你好，有一个问题一直困扰我很久了，我在做ERK的时候，背景总是很脏，怎么洗都洗不掉，我是10%的胶，上样40微升，转膜是0.22的PVDF膜100伏100分钟，封闭是5%的脱脂牛奶2小时，一抗是CST的1:1000两个小时，TBST10分钟洗三次，二抗1:5000一个小时，再用TBST洗10分钟3次。

可是背景总是很脏，一抗是新买新配的还不行，希望能指导一下我，问题到底是出在哪里了

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哪里的二抗？

二抗做过稀释度没？

本人正在做AQP4（29KD），12%的胶，一抗1:1000（一抗为多克隆抗体），二抗1:10000，封闭2小时，结果是多克隆杂带太多，与目的条带分不清，现在很着急啊，请大家指教

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摸索一下一抗的不同稀释度

如1:2000,1:4000等

我现在做的是一个16分子量的蛋白，转膜后立春红染膜条带10-90都很清晰，但是没有曝出条带，一抗是cst的，之前也有一次是这样，结果我又重新利用膜再孵了一次结果曝出了不很清晰的条带，不知是一抗问题还是别的原因。

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二抗呢？

缓冲液的pH呢？

ECL呢？

这些都需要考虑

请教前辈：我做的蛋白分子量25kD，用5%压缩胶，80V，45min，12%分离胶，120V，2h，LB在压缩胶底部是压成一条直线的，但是进入分离胶后就有点分开越下去就越开，有时会出现三条相连的线，显影时发现蛋白会有重影。查了配胶用的tris-hcl，PH是没有问题的。还有相同东西，相同条件配10%的胶跑就没有问题。还请帮忙解疑！谢谢！！

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这个我不太懂，10%的没问题，12%的就有问题

没明白

胶配错了？

用哪个公司的试剂盒呢？

问：还没拿到试剂盒，准备用的是Pierce的NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents（cuturl('http://www.piercenet.com/products/browse.cfm?fldID=06010435')）。还有请教一下，做Cytochrome C，由于其定位于线粒体，提蛋白是否需要特殊处理？我看有的文献就是用总蛋白做的。能检测到吗？正打算做。

）

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实验设计上有具体的要求吗？

是必须要分离线粒体膜蛋白来检测还是/

老师您好，我想请问一下：我跑的蛋白分子量是183。最近跑了几次泳道都很脏，蛋白条带也不是很清楚，反而在250左右条带特别清晰。请问泳道怎么处理？目的条带不清晰主要是什么原因引起的？（上样量为60ug)

谢谢老师，在线等待，O(∩_∩)O~

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有250K的marker？

这个我不太懂，10%的没问题，12%的就有问题

没明白

胶配错了？

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不好意思，表达不清。

胶是没有配错啦，就是用一样的东西配胶，相同条件下跑胶的话，12%的分离胶中溴酚蓝就会散开来。

这种情况不知道是不是导致条带重影的原因。今天用100v压分离胶还是出现这种情况，不知道咋办啊

是的，使用的marker最大分子量为300，fermentas公司的

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哦，分子量在大于100K后，分的就不会像100K以内蛋白那么清楚，150与300K的marker之间可能间隔很小

不好意思，表达不清。

胶是没有配错啦，就是用一样的东西配胶，相同条件下跑胶的话，12%的分离胶中溴酚蓝就会散开来。

这种情况不知道是不是导致条带重影的原因。今天用100v压分离胶还是出现这种情况，不知道咋办啊

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蛋白染色后结果如何呢？