小中大您好：做了三个月的WB，还是没有头绪。我的指标是ucp2（32kd），内参为actin.具体步骤：4%浓缩胶，10%分离胶。上样量是50ug，30ul（1.5mm板)，电泳70V,120V,转膜液20%甲醇（不加SDS）转膜45分钟（伯乐电泳仪），转膜后maker均胶清晰。立春红染膜后，在相应的位置有条带，考马斯蓝染转膜后的胶，未见条带。5%牛奶封闭2小时室温，TBST洗10*3min,Proteintech Group的ucp2一抗1:1000稀释（建议是1:1000，采用碧云天的一抗稀释液，以便抗体再利用），4度摇床过夜，次日约孵育18-20小时，TBST洗10*3min,二抗1:1000（建议是1:1000）室温1h,TBST洗10*3minpiere超强ECL发光曝光，机器曝光。结果：内参较清晰，没有背景。未见目的条带，但在相应的位置有一条线，很细。
我的问题：1、丽春红染色有条带 ，是不是表示转膜之前的步骤是正确的？
2、同个厂家的抗体，我之前有结果出来的，但是用完了，买的是同个厂家的同个抗体，目的条带就没有了，样本实验条件都是一样的，这是什么问题？
3、我的一抗是Proteintech Group公司的，该公司的抗体如何？是不是我抗体问题存在问题？
谢谢！
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一抗有没有做过不同的稀释度啊
