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标题:【讨论帖】western blot问题解答

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发表于 2013-3-15 17:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
分装的不好说

这个看你的运气吧

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版主，那能问下你做 iNOS的一抗除了SANTA的，还有什么公司的比较好，或者国产的也行，能麻烦推荐下吗？谢谢！
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66小飞侠[使用道具]
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发表于 2013-3-15 17:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

楼主，你好，最近我开始做WB，加ECL基本上看不到荧光，可是再加TMB却可以看到明显条带。问题会是在什么地方？我直接在ECL里加了二抗可见荧光，ECL是没问题的。PVDF膜在二抗孵育玩用PBST洗膜后，我又用水漂洗了一下，会是因为这个吗？ECL显色受膜上离子强度和PH影响大吗？
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66小飞侠[使用道具]
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发表于 2013-3-15 17:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
漏到浓缩胶与分离胶之间？

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是的，是漏到浓缩胶和分离胶之间，
我看了另外的帖子说说是封闭用的溶液没有弄干净，可以先用浓缩胶洗一下，去掉后在重新注入，但是我试过了还是不能避免，请高手帮忙看看还有什么可能的原因！谢谢！盼回复
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发表于 2013-3-15 17:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
您好！我现在决定换抗体了，参考文献用的是Santa Cruz，但是目前该抗体的反响不好，我选用abcam的，这样不知道好不好？你能给个建议吗？还有，同是abcam的同个指标，但是有山羊、小鼠，兔来源的，我该如何选择？谢谢！
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发表于 2013-3-15 17:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
目的蛋白：17KDa 内参：37KDa
跑胶电压：上层胶70V，分离胶90V；转膜：250mA，目的时间25分钟，内参时间35分钟。
用的是0.2um的膜
一抗：1：2000 4度过夜（未摇）；二抗：1：2000常温1小时，均是ABCam的
内参：1：2000 碧云天的
ECL plus+显色
显色后是整片空白，什么都没有；然后进行染胶和染膜发现在17和37的位置都是有蛋白的，不知道是什么问题，故请教高手们，给点建议！！！？
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发表于 2013-3-15 17:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问版主如何根据目的蛋白分子量大小来调整转膜的条件。
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发表于 2013-3-15 17:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
您好，我刚开始做WB，我要做的是食管癌细胞叶酸受体的表达，一种膜蛋白，38KD，用的抗体是Enzo公司旗下Alexis的一抗，给的浓度，是1：1000-1：100，二抗是进口分装的，做了一次actin，用的70v，100v电泳，300mA，60min电转，条带有出来，背景不是很高。那我在做目的蛋白的时候您可以给些什么建议吗？该怎么入手把条件给摸好呢，刚开始做，很多不懂，希望不吝赐教，谢谢！
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发表于 2013-3-15 17:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

版主，您好！上一次问您关于Ⅰ型前胶原蛋白的问题，您说“需要注意抗体识别的是还原型的还是非还原型的胶原蛋白”，我现在不太清楚“还原型的和非还原型的胶原蛋白”是指什么意思，有什么区别？我买了Santa Cruz，关于Ⅰ型前胶原蛋白的一抗，看了说明书，给出的图，好像是有两个条带。胶原方面，我刚刚才开始学习，不懂的东西比较多，麻烦版主了，谢谢！


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发表于 2013-3-15 17:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我用的也是六一的电泳仪，我要的是Actin43KD和80多KD的目的蛋白，用60mA稳流跑能把Marker都跑开，然后用90V湿转90min，看胶上的Marker都已经转到PVDF膜上，但是用丽春红染膜，却看不到蛋白条带，望能予以指教。谢谢
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pengke1983[使用道具]
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发表于 2013-3-15 17:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

版主您好，我最近作western遇到一个奇怪的问题，我做western已经半年了，这次是新提的动物蛋白，肾脏的，拿来做内参和目的，内参杂带非常的多，我是用脱脂牛奶封闭了2小时，一抗是1:1000，4°过夜，但是显影五分钟整个胶片像是把膜的大小框也显示了出来，而且非常黑非常乱，但是条带看的还是比较清楚。这是内参，不知道什么问题，是不是一抗不行了？

还有目的是做的LC3B，分子量很小，才14左右，我提的细胞蛋白试了几次都没做出来，都是一片白板，转膜时间是200电流，恒流，60分钟，0.45的PVDF膜。这次换用新提的动物肾脏蛋白做的，条件也换了，用了0.22的PVDF膜，恒流200的电流，50分钟，一抗是CST的1:1000,特别改用BSA封闭，抗体稀释液也都是换成BSA了，显影的时候居然出来了，但是是一团团的浓墨状的黑影，非常晕，不知道到底哪里出了问题，应该怎么改正，谢谢！！
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