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标题:【讨论帖】western blot问题解答

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发表于 2013-3-15 17:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
以前跑的都挺好,可是最近做的几块胶都是这样,我跑的是纤维蛋白原,分子量较大340KD,好象还不是染色没染好,染之前还用NaCl洗了一小下,请大侠帮忙看一下,问题出在哪了.电压是,100V,150V跑的.又做过80V,120V的,也有这样的现象.


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发表于 2013-3-15 17:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
刚刚接触wb，什么都是现学的

有人推荐我用image j来分析荧光图

我对着英文的说明书看了半天也不确定

image j是不是提供两个方法

1、在ps平台测出图像的mean和Pixels，然后再到image j里面进一步操作area，mean还有intden

2、直接image J里面操作，最后得到的是area和percent

如果是这样的话，那得到的这两类数据又该如何进一步分析呢

多谢前辈赐教

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呵呵，我不用ImageJ读数

我自己花了1100美金买了一个软件：Total Lab Quant读取条带的积分光密度值
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发表于 2013-3-15 17:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
以前跑的都挺好,可是最近做的几块胶都是这样,我跑的是纤维蛋白原,分子量较大340KD,好象还不是染色没染好,染之前还用NaCl洗了一小下,请大侠帮忙看一下,问题出在哪了.电压是,100V,150V跑的.又做过80V,120V的,也有这样的现象.

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总蛋白还是纯化后的蛋白呢？
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发表于 2013-3-15 17:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
用了Abcam的，还不错

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我已下订单购买SANTA的一抗了。谢谢

希望能出结果。

对了顺便问下，Abcam的一抗大概多少钱一个？还有SANTA的一抗最便宜是多少钱一个？
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发表于 2013-3-15 17:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我已下订单购买SANTA的一抗了。谢谢

希望能出结果。

对了顺便问下，Abcam的一抗大概多少钱一个？还有SANTA的一抗最便宜是多少钱一个？

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abcam的抗体网上有报价，你可以上去看看
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发表于 2013-3-15 17:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大



楼主，这是我第一次跑的 β-actin，8%的胶。电泳条件是 80v，30min，100v60min，转膜的条件是 250mA 1h，蛋白的量大概在45μg左右，结果图就成这个样子了，请帮忙分析一下原因，为什么条带是一条线啊？多谢


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发表于 2013-3-15 17:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
什么指标呢？样品的种属是什么？

==========

ucp2,人
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发表于 2013-3-15 17:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
版主，您好！我最近在跑一个32kD的蛋白，显影出来总是背景特别深，之后显了GD，很好，条带很清晰；后来，降低了二抗浓度，从1:1000降到1:2000，未显出来。又提高了，使用1:1500，显出来了，可是背景还是很深。后来也在孵完二抗后，洗了50min，背景仍然比较深。我用5%脱脂牛奶封闭2H，一抗孵过夜，洗40min，二抗孵2H，洗50min。请教版主，您有没有碰到过这种情况，到底问题出在哪？应该怎么解决啊？我用的是Santa Cruz的抗体。谢谢！
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发表于 2013-3-15 17:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

版主你好，我作western blot,提取脑组织蛋白。提取的蛋白开始一两次WB效果可以；1,2次以后，EP管内就出现白色沉淀，跑不出蛋白条带？我的蛋白提取变性后冻存在-40度。请版主解惑，谢谢！
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发表于 2013-3-15 17:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
版主，您好！我最近在跑一个32kD的蛋白，显影出来总是背景特别深，之后显了GD，很好，条带很清晰；后来，降低了二抗浓度，从1:1000降到1:2000，未显出来。又提高了，使用1:1500，显出来了，可是背景还是很深。后来也在孵完二抗后，洗了50min，背景仍然比较深。我用5%脱脂牛奶封闭2H，一抗孵过夜，洗40min，二抗孵2H，洗50min。请教版主，您有没有碰到过这种情况，到底问题出在哪？应该怎么解决啊？我用的是Santa Cruz的抗体。谢谢！

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能不能告诉我你上样的量，电泳，转膜的条件？我的蛋白也是32kd，是UCP2，你的呢？做了好长时间了，都没有结果。谢谢！
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