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标题:【讨论帖】western blot问题解答

junjie05[使用道具]
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发表于 2013-3-15 17:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我做的是il-8，分子量只有10kd左右，一直做不出来，对于小分子蛋白，不知道还有什么优化实验的方法呢？
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junjie05[使用道具]
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发表于 2013-3-15 17:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

应该如何选择合适的内参。

如果内参和目的都是在34-43kd之间的话怎么办？gapdh和β-Actin都是在这个范围的，而用β-Tublin 效果又不明显。
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wsll[使用道具]
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发表于 2013-3-15 17:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
能不能告诉我你上样的量，电泳，转膜的条件？我的蛋白也是32kd，是UCP2，你的呢？做了好长时间了，都没有结果。谢谢！

===============================================================================================================

我的上样量是18μl。电泳用的是稳压，80V积层胶，120V分离胶；转膜用的是稳流，350mV，2,5h。我做的是细胞凋亡方面的一个蛋白，ARTS。
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ququer787[使用道具]
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发表于 2013-3-15 17:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

求教！最近做了PLN,分子量25（五聚体），6（单体）。出来的条带宽大相连，丰度比β-actin还高。分别调整了上样量，一抗二抗浓度，封闭时间，封闭液，结果还是这样。老板对结果很不满意，请做过这个蛋白的战友、前辈帮我看看，有没有其他更好的调整办法。谢谢！！bbcodeurl('file:///C:\Users\ADMINI~1.DAD\AppData\Local\Temp\ksohtml\wps_clip_image-13753.png', '%s')

上面这张是pln的，下面是β-actin的bbcodeurl('file:///C:\Users\ADMINI~1.DAD\AppData\Local\Temp\ksohtml\wps_clip_image-13995.png', '%s')

蛋白处理：常温,未变性。 蛋白上样量20ug蛋白上样体积25ul电泳 电压80v4h
转膜300mA2h
封闭3%BSA30min
一抗PLN(UPSTATE) :1:5000
β -actin 1:500.4℃ 过夜
封闭3%BSA,30min
二抗 1:10001.5h
曝光时间PLN 90s;β-actin 90s
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ququer787[使用道具]
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发表于 2013-3-15 17:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
求教！最近做了PLN,分子量25（五聚体），6（单体）。出来的条带宽大相连，丰度比β-actin还高。分别调整了上样量，一抗二抗浓度，封闭时间，封闭液，结果还是这样。老板对结果很不满意，请做过这个蛋白的战友、前辈帮我看看，有没有其他更好的调整办法，谢谢！！

蛋白处理：常温,未变性。 蛋白上样量20ug蛋白上样体积25ul电泳 电压80v4h
转膜300mA2h
封闭3%BSA30min
一抗PLN(UPSTATE) :1:5000
β -actin 1:500.4℃ 过夜
封闭3%BSA,30min
二抗 1:10001.5h
曝光时间PLN 90s;β-actin 90s
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发表于 2013-3-15 17:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你好，我最近几次做WB都发现在暗室发光可以看到很亮的条带，但是一压胶片什么都暴不出来，压两小时都看不到条到。可是转膜染色可以看到很漂亮的条带，滴上发光液也可以看到明显的条带没背景，就是压胶片显不出条带胡或者胶片发黑。以前有一次NC膜stripe3次后出现过这样的情况。但这几次新转的膜也是这样。换了新买的发光液也是这样……求解。

可能原因稀释好的一抗在4度放置时间太久，效价降低了。我以前是用一抗稀释液稀释，但是最近用完了，就用PBST稀释，而且放了3周多了。如果没有一抗稀释液一般可以用什么稀释，因为筛选下游分子我的抗体是从其他组借的，一次只能拿1ml稀释好抗体的，所以比较珍惜，每次点膜都是加100ul的。

之前做出来的条带还勉强可以，但最近想再做做，发出好点的胶片就悲剧了。求指教。下面是以前和最近的的图片比较^………………bbcodeurl('file://D:\360data\重要数据\桌面\1.jpg', '%s')bbcodeurl('file://D:\360data\重要数据\桌面\2.jpg', '%s')
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发表于 2013-3-15 17:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
最近GAPDH都做得很心烦，可惜图传不上来。
我提的是大鼠心肌组织蛋白，液氮研磨加三去污裂解，转膜后5%BSATBST封闭1小时，GAPDH是康城的带HRP，4度1：5000孵育过夜，ECL用的是进口超敏ECL（忘记什么公司了），该图片曝光10s，别人做出来都是1条带，而我却有二至三条！曝光完我发现膜上出现黄色条带，是不是蛋白浓度太高HRP富集导致的”烧灼样“？
我们实验室的老师说是我蛋白上样太多，下次减到20ug，GAPDH用1：10000。
不知大师是不是一样指教？
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发表于 2013-3-15 17:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
楼主，这是我第一次跑的 β-actin，8%的胶。电泳条件是 80v，30min，100v60min，转膜的条件是 250mA 1h，蛋白的量大概在45μg左右，结果图就成这个样子了，请帮忙分析一下原因，为什么条带是一条线啊？多谢

=======================

以前出现过类似的结果吗？
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发表于 2013-3-15 17:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
ucp2,人

===================

如果步骤没问题的话

投诉一下抗体吧
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发表于 2013-3-15 17:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
版主，您好！我最近在跑一个32kD的蛋白，显影出来总是背景特别深，之后显了GD，很好，条带很清晰；后来，降低了二抗浓度，从1:1000降到1:2000，未显出来。又提高了，使用1:1500，显出来了，可是背景还是很深。后来也在孵完二抗后，洗了50min，背景仍然比较深。我用5%脱脂牛奶封闭2H，一抗孵过夜，洗40min，二抗孵2H，洗50min。请教版主，您有没有碰到过这种情况，到底问题出在哪？应该怎么解决啊？我用的是Santa Cruz的抗体。谢谢！

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有一点可以很确定的告诉你

二抗从1：1000提高到1：2000不会有质上的区别，即1：1000有条带，而1：2000没有条带。如果出现这种情况要考虑试剂或者操作的问题

二抗孵育40min，室温，足够了
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