蛋白质与蛋白组学

版主你好，我作western blot,提取脑组织蛋白。提取的蛋白开始一两次WB效果可以；1,2次以后，EP管内就出现白色沉淀，跑不出蛋白条带？我的蛋白提取变性后冻存在-40度。请版主解惑，谢谢！

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变性时的蛋白浓度是多少？

我做的是il-8，分子量只有10kd左右，一直做不出来，对于小分子蛋白，不知道还有什么优化实验的方法呢？

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不适合用WB来检测

应该如何选择合适的内参。

如果内参和目的都是在34-43kd之间的话怎么办？gapdh和β-Actin都是在这个范围的，而用β-Tublin 效果又不明显。

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做完目的蛋白后

把目的抗体stripping 掉

然后孵育内参

求教！最近做了PLN,分子量25（五聚体），6（单体）。出来的条带宽大相连，丰度比β-actin还高。分别调整了上样量，一抗二抗浓度，封闭时间，封闭液，结果还是这样。老板对结果很不满意，请做过这个蛋白的战友、前辈帮我看看，有没有其他更好的调整办法。谢谢！！bbcodeurl('file:///C:\Users\ADMINI~1.DAD\AppData\Local\Temp\ksohtml\wps_clip_image-13753.png', '%s')

上面这张是pln的，下面是β-actin的bbcodeurl('file:///C:\Users\ADMINI~1.DAD\AppData\Local\Temp\ksohtml\wps_clip_image-13995.png', '%s')

蛋白处理：常温,未变性。 蛋白上样量20ug蛋白上样体积25ul电泳 电压80v4h
转膜300mA2h
封闭3%BSA30min
一抗PLN(UPSTATE) :1:5000
β -actin 1:500.4℃ 过夜
封闭3%BSA,30min
二抗 1:10001.5h
曝光时间PLN 90s;β-actin 90s

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调整一抗稀释度

你好，我最近几次做WB都发现在暗室发光可以看到很亮的条带，但是一压胶片什么都暴不出来，压两小时都看不到条到。可是转膜染色可以看到很漂亮的条带，滴上发光液也可以看到明显的条带没背景，就是压胶片显不出条带胡或者胶片发黑。以前有一次NC膜stripe3次后出现过这样的情况。但这几次新转的膜也是这样。换了新买的发光液也是这样……求解。

可能原因稀释好的一抗在4度放置时间太久，效价降低了。我以前是用一抗稀释液稀释，但是最近用完了，就用PBST稀释，而且放了3周多了。如果没有一抗稀释液一般可以用什么稀释，因为筛选下游分子我的抗体是从其他组借的，一次只能拿1ml稀释好抗体的，所以比较珍惜，每次点膜都是加100ul的。

之前做出来的条带还勉强可以，但最近想再做做，发出好点的胶片就悲剧了。求指教。下面是以前和最近的的图片比较^………………bbcodeurl('file://D:\360data\重要数据\桌面\1.jpg', '%s')bbcodeurl('file://D:\360data\重要数据\桌面\2.jpg', '%s')

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胶片或者显影液的问题（如果在压片前还能看到荧光的话）

最近GAPDH都做得很心烦，可惜图传不上来。
我提的是大鼠心肌组织蛋白，液氮研磨加三去污裂解，转膜后5%BSATBST封闭1小时，GAPDH是康城的带HRP，4度1：5000孵育过夜，ECL用的是进口超敏ECL（忘记什么公司了），该图片曝光10s，别人做出来都是1条带，而我却有二至三条！曝光完我发现膜上出现黄色条带，是不是蛋白浓度太高HRP富集导致的”烧灼样“？
我们实验室的老师说是我蛋白上样太多，下次减到20ug，GAPDH用1：10000。
不知大师是不是一样指教？

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超敏的ECL？Pierce（Thermo）的？

调整一抗浓度

做完目的蛋白后

把目的抗体stripping 掉

然后孵育内参

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如何stripping？

不适合用WB来检测

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为什么呢？能解释一下嘛？

为什么呢？能解释一下嘛？

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IL-8是分泌型蛋白

如何stripping？

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用stripping buffer