蛋白质与蛋白组学

老师你好，我显色的时候，一下就出来了，
但是压片盒里面压片的时候就突然没了，
是怎么回事？
用的碧云天的ECLplus

另外曝光的时候底片容易变深，是什么回事啊？
显影液定影液用哪家的好

压片盒那个白色的屏用什么洗？无水乙醇

谢谢

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1、这种情况一般是二抗浓度太高，稀释二抗试试

2、容易变深是因为胶片走光。显影、定影用国产的就没问题

3、白色瓶用水，湿纱布擦擦就行

谢谢NBA老师。我一直也用总蛋白做的，但是文献上都是先提取线粒体，再提线粒体蛋白来做。考虑到我的样本是收集的人体细胞，没有经过培养，数量相对少，所以一直提取总蛋白进行做的。可是结果总是不理想。

指标:ucp2（32kd），内参:actin.具体步骤：

1.制胶：4%浓缩胶，10%分离胶。上样量是50ug，30ul（1.5mm板)；

2.电泳：70V,120V；

3.转膜：转膜液：20%甲醇（不加SDS）300ma转膜45分钟（伯乐电泳仪）（转膜后maker均胶清晰。立春红染膜后，在相应的位置有条带，考马斯蓝染转膜后的胶，见少许条带残留。）；

4.5%牛奶封闭2小时室温，TBST洗15*3min；

5.一抗ucp2 santa cruz 山羊抗人（C-20）1:200 （建议稀释1:100-1：1000，条带在35kd），4度摇床过夜，次日约孵育18-20小时，TBST洗，15*3min；

6.二抗 中杉 兔抗羊1:1000（建议是1:1000-1:10000）室温1h,TBST洗15*3min，

7.piere超强ECL发光曝光5s，机器曝光。

结果：内参较清晰，没有背景。目的：在35kd上下各有一条，相距较近。
方老师：帮我看看有哪里可以改进的，谢谢！盼早日回复！

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1、UCP2可能在细胞中表达较弱

2、有图片吗？

老师：您好。我做的是人正常肝细胞LO2的bax和bcl-2。上样量是10微升，蛋白量为30.后来改为50，80.100，但是总是β-action出来，而目标蛋白出不来。抗体是sunta的，电泳仪和电转仪都是bio-rad，电泳条件是100v，1h30min（12％的胶），湿转，100v，45min（30min也试过）。5％脱脂奶粉封闭1h，一抗（鼠抗）过夜1：200-1000都试过，二抗（抗鼠抗）1：5000.碧云天ECL显色液，次次都是β-action出来，而目标蛋白死也出不来。原先以为是抗体不好，但是做小鼠的组织蛋白，就可以。

一直不知道问题出在什么地方，请老师指教！

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这几个抗体能识别人的吗？

这几个抗体能识别人的吗？

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说明书上说可以识别人、小鼠和大鼠的蛋白

我想比较肺癌组织培养液上清与正常肺组织培养液上清中的3种蛋白质含量，如何选择内参，查文献发现这些上清中不存在β-actin，β-tubulin等常用的内参，但看到有人提到可引入外源性的参照物，好像就是将一定量的β-actin或β-tubulin加入到一定体积的上清中，再进行western，由于加入的β-actin或β-tubulin是已知的，因此，也可作为参照来比较上清中多种蛋白质的含量。
请问楼主这样行得通吗？还有没有其它的办法比较？

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比较上清液中蛋白的变化可以用ELISA啊，买相关试剂盒就行，比WB好做

调整一下一抗的稀释度

不行可以投诉抗体

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谢谢楼主 我换了一家公司的抗体 出结果了 还不错，
应该就是抗体的事了。