【讨论帖】western blot问题解答 - 经验共享 - 分析测试百科

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标题:【讨论帖】western blot问题解答

birdfish[使用道具]
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发表于 2013-3-18 12:27 资料个人空间短消息加为好友

小中大

小弟做WB次数不多，有这麽个问题：

我做的是植物叶片提取的蛋白，过程是：TCA/Acetone法制备蛋白样品，裂解后蛋白浓度未定量，一般在1-5mg/ml，12%SDS-PAGE 40-60V电泳5小时（电极缓冲液是新配的），NC膜过夜转膜（转膜缓冲液用过大概3次多了），牛血清蛋白封闭大概3小时，一抗混合着兔抗内参rubisco大亚基52kDa、兔抗70kDa蛋白和兔抗90kDa蛋白的抗体（抗体说明书写着1:3000稀释，我按1:1000稀释）室温孵育2小时，TBST洗膜3*10min，二抗羊抗兔标记碱性磷酸酶（AP）1:5000室温孵育1小时，TBST洗膜3*10min，膜上加入底物NBT/BCIP避光反应5-10min。

现在的问题是：做了很多次，每次都只能看到70kDa和内参rubisco的显色条带，却一点都看不到90kDa的条带。据维基百科查，90kDa蛋白在总蛋白中正常含量约1%-2%，一抗用的全部是瑞典agrisera公司的商品化抗体，抗原都来自拟南芥。（但是按照90kDa蛋白抗体说明书上写着该抗原属于该蛋白家族中的一种异构体）请问版主这会是啥原因？谢谢版主大人！

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发表于 2013-3-18 12:27 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你好，我第一次做WB,电泳跑出来的marker从43到72分子量的都没有分开，是怎么回事呀，实验室有人说是胶配的不好，但小分子量得分的很开？

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发表于 2013-3-18 12:27 资料个人空间短消息加为好友

小中大

说明书上说可以识别人、小鼠和大鼠的蛋白

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这个就不好说了

只能说是种属及组织特异性不同

把小鼠的样品处理好后先跑个电泳，染胶看看

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发表于 2013-3-18 12:28 资料个人空间短消息加为好友

小中大

您好，问个比较基础的问题，我们得到的westernblot结果是目的蛋白灰度值比内参灰度值，然后用这个结果进行t检验吗？

================================

使用比值进行统计检测

这个比值还需要进行normalization处理

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发表于 2013-3-18 12:28 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你好，这是我跑的小鼠血清白蛋白的WB，上样量是1：20稀释的血清10微升，一抗（abcam）1:5000稀释，二抗(中杉)1:3000，用bio-rad的机器曝的光，但是跑出来的结果不好，麻烦您给指导一下，非常感谢！
bbcodeurl('file:///C:/Users/ADMINI~1/AppData/Local/Temp/msohtml1/01/clip_image001.jpg', '%s')

========================

1:100稀释样品，上样1ul

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发表于 2013-3-18 12:29 资料个人空间短消息加为好友

小中大

如果我的目的蛋白分子量比较接近，我想通过重复染膜来检测这几个指标，我应该咋处理已染过的膜呢？都需要注意些什么？

谢谢！

=====================================================

目的蛋白1抗体，二抗，曝光

Stripping，封闭，目的蛋白2抗体，二抗，曝光。。。以此类推

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发表于 2013-3-18 12:29 资料个人空间短消息加为好友

小中大

老师您好

最近在做LC3蛋白，条带都能出来，但是背景很脏，不知道怎么处理。。。。。

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调整二抗及洗膜时间

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发表于 2013-3-18 12:29 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你好，我第一次做WB,电泳跑出来的marker从43到72分子量的都没有分开，是怎么回事呀，实验室有人说是胶配的不好，但小分子量得分的很开？

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胶浓度多少？

redbutterfly[使用道具]
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发表于 2013-3-18 12:30 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我今天做了WB 用恒流300mA湿转了1.5个小时转完后发现PVDF膜上的maker在55KD以下就有点漂了想向您请教一下可能是那些原因呀？谢谢您了

静待佳音

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发表于 2013-3-18 12:30 资料个人空间短消息加为好友

小中大

老师你好！

最近做核蛋白，用的H3做内参，但是它的位置和上样缓冲液的蓝色在一起了，怎么办？
还有什么常用的核蛋白内参？
磷酸化蛋白洗膜后还能做出来么？因为有2个磷酸化位点

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